Chemická zložka špirálových hadičiek z nehrdzavejúcej ocele 304, Štruktúra ektodomény SPACA6 obsahuje konzervovanú nadrodinu proteínov spojených s fúziou gamét.

Ďakujeme, že ste navštívili Nature.com.Používate verziu prehliadača s obmedzenou podporou CSS.Pre najlepší zážitok vám odporúčame použiť aktualizovaný prehliadač (alebo vypnúť režim kompatibility v programe Internet Explorer).Okrem toho, aby sme zabezpečili nepretržitú podporu, zobrazujeme stránku bez štýlov a JavaScriptu.
Posúvače zobrazujúce tri články na snímke.Na posúvanie medzi snímkami použite tlačidlá späť a ďalej, na posúvanie sa po jednotlivých snímkach použite tlačidlá ovládača posúvania na konci.

SPACA6 je povrchový proteín exprimovaný spermiami, ktorý je rozhodujúci pre fúziu gamét počas sexuálnej reprodukcie cicavcov.Napriek tejto základnej úlohe je špecifická funkcia SPACA6 nedostatočne pochopená.Objasňujeme kryštálovú štruktúru extracelulárnej domény SPACA6 s rozlíšením 2, 2 Á, odhaľujúc dvojdoménový proteín zložený zo štvorvláknového zväzku a Ig-podobných β-sendvičov spojených kvázi flexibilnými linkermi.Táto štruktúra sa podobá IZUMO1, inému proteínu spojenému s fúziou gamét, vďaka čomu sú SPACA6 a IZUMO1 zakladajúcimi členmi nadrodiny proteínov spojených s oplodnením, ktoré sa tu označujú ako nadrodina IST.Nadrodina IST je štrukturálne definovaná svojim skrúteným zväzkom štyroch helixov a párom disulfidovo spojených motívov CXXC.Štruktúrne založené vyhľadávanie AlphaFold ľudského proteómu identifikovalo ďalšie proteínové členy tejto superrodiny;najmä mnohé z týchto proteínov sa podieľajú na fúzii gamét.Štruktúra SPACA6 a jej vzťah k iným členom superrodiny IST poskytujú chýbajúce spojenie v našich poznatkoch o fúzii gamét cicavcov.
Každý ľudský život začína dvoma samostatnými haploidnými gamétami: spermiou otca a vajíčkom matky.Táto spermia je víťazom intenzívneho selekčného procesu, počas ktorého milióny spermií prechádzajú ženským pohlavným traktom, prekonávajú rôzne prekážky1 a podstupujú kapacitu, čo zvyšuje ich pohyblivosť a proces povrchových komponentov2,3,4.Aj keď sa spermie a oocyt navzájom nájdu, proces sa ešte neskončil.Oocyt je obklopený vrstvou kumulických buniek a glykoproteínovou bariérou nazývanou zona pellucida, cez ktorú musia spermie prejsť, aby vstúpili do oocytu.Spermie používajú kombináciu povrchových adhéznych molekúl a membránovo asociovaných a vylučovaných enzýmov na prekonanie týchto konečných bariér5.Tieto molekuly a enzýmy sú uložené hlavne vo vnútornej membráne a akrozomálnej matrici a sú detekované, keď je vonkajšia membrána spermií lyzovaná počas akrozomálnej reakcie6.Posledným krokom na tejto intenzívnej ceste je fúzia spermií a vajíčok, pri ktorej dve bunky splynú svoje membrány, aby sa stali jediným diploidným organizmom7.Aj keď je tento proces prelomový v ľudskej reprodukcii, potrebné molekulárne interakcie nie sú dostatočne pochopené.
Okrem oplodnenia gamét sa rozsiahlo študovala chémia fúzie dvoch lipidových dvojvrstiev.Vo všeobecnosti je membránová fúzia energeticky nepriaznivý proces, ktorý vyžaduje, aby proteínový katalyzátor prešiel štrukturálnou konformačnou zmenou, ktorá priblíži dve membrány k sebe, naruší ich kontinuitu a spôsobí fúziu8,9.Tieto proteínové katalyzátory sú známe ako fuzogény a boli nájdené v nespočetných fúznych systémoch.Sú potrebné na vstup vírusu do hostiteľských buniek (napr. gp160 v HIV-1, nárast v koronavírusoch, hemaglutinín v chrípkových vírusoch)10,11,12 placentárne (syncytín)13,14,15 a fúzie tvoriace gaméty v nižších eukaryotoch ( HAP2/GCS1 u rastlín, protistov a článkonožcov) 16,17,18,19.Fuzogény pre ľudské gaméty musia byť ešte objavené, hoci sa ukázalo, že niekoľko proteínov je kritických pre pripojenie a fúziu gamét.CD9 exprimovaný v oocytoch, transmembránový proteín potrebný na fúziu myších a ľudských gamét, bol prvý objavený 21,22,23.Hoci jeho presná funkcia zostáva nejasná, zdá sa pravdepodobná úloha v adhézii, štruktúra adhéznych ložísk na vaječných mikroklkoch a/alebo správna lokalizácia povrchových proteínov oocytov 24,25,26.Dva najtypickejšie proteíny, ktoré sú rozhodujúce pre fúziu gamét, sú spermie proteín IZUMO127 a oocytový proteín JUNO28 a ich vzájomná asociácia je dôležitým krokom v rozpoznávaní a adhézii gamét pred fúziou.Samce Izumo1 knockout myší a samice Juno knockout myší sú úplne sterilné, v týchto modeloch spermie vstupujú do perivitelínového priestoru, ale gaméty sa nespájajú.Podobne sa konfluencia znížila, keď sa gaméty ošetrili protilátkami anti-IZUMO1 alebo JUNO27,29 v experimentoch s ľudským oplodnením in vitro.
Nedávno bola objavená novoobjavená skupina proteínov exprimovaných v spermiách fenotypicky podobných IZUMO1 a JUNO20,30,31,32,33,34,35.Proteín 6 spojený s akrozomálnou membránou spermií (SPACA6) bol identifikovaný ako nevyhnutný pre oplodnenie vo veľkej štúdii mutagenézy u myší.Inzercia transgénu do génu Spaca6 produkuje nefúzovateľné spermie, aj keď tieto spermie infiltrujú perivitelínový priestor36.Následné knockout štúdie na myšiach potvrdili, že Spaca6 je potrebný na fúziu gamét30,32.SPACA6 je exprimovaný takmer výlučne v semenníkoch a má podobný lokalizačný vzor ako IZUMO1, konkrétne vo vnútri intimy spermií pred akrozomálnou reakciou a potom migruje do rovníkovej oblasti po akrozomálnej reakcii 30,32.Homológy Spaca6 existujú u rôznych cicavcov a iných eukaryotov30 a jeho dôležitosť pre fúziu ľudských gamét bola preukázaná inhibíciou ľudského oplodnenia in vitro rezistenciou voči SPACA630.Na rozdiel od IZUMO1 a JUNO zostávajú detaily štruktúry, interakcií a funkcie SPACA6 nejasné.
Aby sme lepšie pochopili základný proces, ktorý je základom fúzie ľudských spermií a vajíčok, čo nám umožní informovať o budúcom vývoji v plánovaní rodiny a liečbe plodnosti, vykonali sme štrukturálne a biochemické štúdie SPACA6.Kryštalická štruktúra extracelulárnej domény SPACA6 ukazuje štvorzávitnicový zväzok (4HB) a doménu podobnú imunoglobulínu (podobnú Ig) spojenú kvázi flexibilnými oblasťami.Ako sa predpokladalo v predchádzajúcich štúdiách,7,32,37 doménová štruktúra SPACA6 je podobná štruktúre ľudského IZUMO1 a tieto dva proteíny zdieľajú neobvyklý motív: 4HB s trojuholníkovým špirálovitým povrchom a párom disulfidovo spojených motívov CXXC.Navrhujeme, aby IZUMO1 a SPACA6 teraz definovali väčšiu, štrukturálne príbuznú superrodinu proteínov spojených s fúziou gamét.Pomocou funkcií jedinečných pre nadrodinu sme vykonali vyčerpávajúce vyhľadávanie štrukturálneho ľudského proteómu AlphaFold, pričom sme identifikovali ďalších členov tejto nadrodiny, vrátane niekoľkých členov zapojených do fúzie a / alebo oplodnenia gamét.Teraz sa zdá, že existuje spoločný štrukturálny záhyb a nadrodina proteínov spojených s fúziou gamét a naša štruktúra poskytuje molekulárnu mapu tohto dôležitého aspektu mechanizmu fúzie ľudských gamét.
SPACA6 je jednopriechodový transmembránový proteín s jedným N-pripojeným glykánom a šiestimi predpokladanými disulfidovými väzbami (obrázky S1a a S2).Vyjadrili sme extracelulárnu doménu ľudského SPACA6 (zvyšky 27-246) v bunkách Drosophila S2 a čistili sme proteín pomocou afinity niklu, výmeny katiónov a vylučovacej chromatografie (obr. S1b).Purifikovaná ektodoména SPACA6 je veľmi stabilná a homogénna.Analýza pomocou vylučovacej chromatografie v kombinácii s polygonálnym rozptylom svetla (SEC-MALS) odhalila jeden vrchol s vypočítanou molekulovou hmotnosťou 26,2 ± 0,5 kDa (obr. S1c).To je v súlade s veľkosťou monomérnej ektodomény SPACA6, čo naznačuje, že počas purifikácie nenastala oligomerizácia.Okrem toho spektroskopia kruhového dichroizmu (CD) odhalila zmiešanú štruktúru α/β s teplotou topenia 51,3 °C (obr. S1d,e).Dekonvolúcia CD spektier odhalila 38,6 % a-helikálnych a 15,8 % p-vláknových prvkov (obrázok S1d).
Ektodoména SPACA6 sa kryštalizovala pomocou náhodného očkovania matricou38, čo viedlo k súboru údajov s rozlíšením 2,2 Á (tabuľka 1 a obrázok S3).Použitím kombinácie údajov molekulárnej substitúcie založenej na fragmentoch a údajov o fázovaní SAD s expozíciou bromidu na stanovenie štruktúry (tabuľka 1 a obrázok S4), konečný spresnený model pozostáva zo zvyškov 27–246.V čase určenia štruktúry neboli k dispozícii žiadne experimentálne štruktúry ani štruktúry AlphaFold.Ektodoména SPACA6 meria 20 Å × 20 Å × 85 Å, pozostáva zo siedmich helixov a deviatich β-reťazcov a má predĺžený terciárny záhyb stabilizovaný šiestimi disulfidovými väzbami (obr. 1a, b).Slabá elektrónová hustota na konci vedľajšieho reťazca Asn243 naznačuje, že tento zvyšok je N-pripojená glykozylácia.Štruktúra pozostáva z dvoch domén: N-koncového zväzku štyroch helixov (4HB) a C-koncovej Ig-podobnej domény so strednou pántovou oblasťou medzi nimi (obr. 1c).
a Štruktúra extracelulárnej domény SPACA6.Strip diagram extracelulárnej domény SPACA6, farba reťazca od N po C-koniec od tmavo modrej po tmavo červenú.Cysteíny zapojené do disulfidových väzieb sú zvýraznené purpurovo.b Topológia extracelulárnej domény SPACA6.Použite rovnakú farebnú schému ako na obrázku 1a.c SPACA6 extracelulárna doména.4HB, pánt a Ig-like doménové pásy sú zafarbené oranžovou, zelenou a modrou farbou.Vrstvy nie sú nakreslené v mierke.
4HB doména SPACA6 zahŕňa štyri hlavné helixy (helixy 1–4), ktoré sú usporiadané vo forme helikálnej špirály (obr. 2a), striedajúce sa medzi antiparalelnými a paralelnými interakciami (obr. 2b).Kolmo na zväzok je položená malá prídavná jednootáčková špirála (závitnica 1′), ktorá tvorí trojuholník so skrutkovnicami 1 a 2. Tento trojuholník je mierne deformovaný v špirálovito stočenej náplni relatívne hustého zloženia špirálok 3 a 4 ( Obr. 2a).
4HB N-terminálna pásková tabuľka.b Pohľad zhora na zväzok štyroch špirál, každá špirála zvýraznená tmavomodrou farbou na N-konci a tmavočervenou farbou na C-konci.c Diagram špirálového kolesa zhora nadol pre 4HB, pričom každý zvyšok je zobrazený ako kruh označený jednopísmenovým kódom aminokyseliny;len štyri aminokyseliny v hornej časti kolesa sú očíslované.Nepolárne zvyšky sú sfarbené do žlta, polárne nenabité zvyšky na zeleno, kladne nabité zvyšky na modro a záporne nabité na červeno.d Trojuholníkové plochy domény 4HB so 4HB v oranžovej farbe a pánty v zelenej farbe.Obidve vložky vykazujú tyčinkovité disulfidové väzby.
4HB je koncentrovaný na vnútornom hydrofóbnom jadre zloženom prevažne z alifatických a aromatických zvyškov (obr. 2c).Jadro obsahuje disulfidovú väzbu medzi Cys41 a Cys55, ktorá spája špirály 1 a 2 do horného vyvýšeného trojuholníka (obr. 2d).Dve ďalšie disulfidové väzby sa vytvorili medzi motívom CXXC v Helix 1' a ďalším motívom CXXC nachádzajúcim sa na špičke β-vlásenky v oblasti pántu (obr. 2d).Konzervatívny arginínový zvyšok s neznámou funkciou (Arg37) sa nachádza vo vnútri dutého trojuholníka tvoreného špirálami 1′, 1 a 2. Alifatické atómy uhlíka Cβ, Cγ a Cδ Arg37 interagujú s hydrofóbnym jadrom a jeho guanidínové skupiny sa cyklicky pohybujú medzi helixmi 1 'a 1 prostredníctvom interakcií medzi Thr32 kostrou a bočným reťazcom (obr. S5a,b).Tyr34 zasahuje do dutiny a zanecháva dve malé dutiny, cez ktoré môže Arg37 interagovať s rozpúšťadlom.
Ig-podobné β-sendvičové domény sú veľkou nadrodinou proteínov, ktoré zdieľajú spoločnú vlastnosť dvoch alebo viacerých viacvláknových amfipatických β-listov interagujúcich prostredníctvom hydrofóbneho jadra 39. C-terminálna Ig-podobná doména SPACA6 má rovnaký vzor a pozostáva z dvoch vrstiev (obr. S6a).List 1 je β-list štyroch vlákien (reťazcov D, F, H a I), kde vlákna F, H a I tvoria antiparalelné usporiadanie a vlákna I a D preberajú paralelnú interakciu.Tabuľka 2 je malý antiparalelný dvojvláknový beta list (vlákna E a G).Vnútorná disulfidová väzba bola pozorovaná medzi C-koncom E reťazca a stredom H reťazca (Cys170-Cys226) (obr. S6b).Táto disulfidová väzba je analogická s disulfidovou väzbou v β-sendvičovej doméne imunoglobulínu40,41.
Štvorvláknový β-list sa krúti po celej dĺžke a vytvára asymetrické okraje, ktoré sa líšia tvarom a elektrostatikou.Tenší okraj je plochý hydrofóbny povrch prostredia, ktorý vyniká v porovnaní so zostávajúcimi nerovnými a elektrostaticky odlišnými povrchmi v SPACA6 (obr. S6b, c).Halogén exponovaných karbonylových/aminoskupín hlavného reťazca a polárnych bočných reťazcov obklopuje hydrofóbny povrch (obr. S6c).Širší okraj je pokrytý zakončeným špirálovitým segmentom, ktorý blokuje N-koncovú časť hydrofóbneho jadra a tvorí tri vodíkové väzby s otvorenou polárnou skupinou hlavného reťazca F reťazca (obr. S6d).C-koncová časť tohto okraja tvorí veľkú kapsu s čiastočne odkrytým hydrofóbnym jadrom.Vrecko je obklopené kladnými nábojmi v dôsledku troch sád dvojitých arginínových zvyškov (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 a Arg212-Arg214) a centrálneho histidínu (His220) (obrázok S6e).
Pántová oblasť je krátky segment medzi špirálovou doménou a doménou podobnou Ig, pozostávajúci z jednej antiparalelnej trojvláknovej β-vrstvy (reťazce A, B a C), malej 310 špirály a niekoľkých dlhých náhodných špirálových segmentov.(obr. S7).Zdá sa, že sieť kovalentných a elektrostatických kontaktov v pántovej oblasti stabilizuje orientáciu medzi 4HB a doménou podobnou Ig.Sieť je možné rozdeliť na tri časti.Prvá časť obsahuje dva motívy CXXC (27CXXC30 a 139CXXC142), ktoré tvoria pár disulfidových väzieb medzi β-vlásenkou v závese a 1′ špirálou v 4HB.Druhá časť zahŕňa elektrostatické interakcie medzi doménou podobnou Ig a pántom.Glu132 v pánte tvorí soľný mostík s Arg233 v doméne podobnej Ig a Arg135 v pánte.Tretia časť obsahuje kovalentnú väzbu medzi doménou podobnou Ig a pántovou oblasťou.Dve disulfidové väzby (Cys124-Cys147 a Cys128-Cys153) spájajú pántovú slučku so spojkou, ktorá je stabilizovaná elektrostatickými interakciami medzi Gln131 a funkčnou skupinou hlavného reťazca, čo umožňuje prístup k prvej doméne podobnej Ig.reťaz.
Štruktúra ektodomény SPACA6 a jednotlivé štruktúry 4HB a Ig-podobných domén sa použili na vyhľadávanie štruktúrne podobných záznamov v proteínových databázach42.Identifikovali sme zhody s vysokým skóre Dali Z, malými štandardnými odchýlkami a veľkými skóre LALI (druhé je počet štruktúrne ekvivalentných zvyškov).Zatiaľ čo prvých 10 zásahov z úplného vyhľadávania ektodomény (tabuľka S1) malo prijateľné Z-skóre > 842, samotné hľadanie 4HB alebo domény podobnej Ig ukázalo, že väčšina týchto zásahov zodpovedala iba β-sendvičom.všadeprítomný záhyb nachádzajúci sa v mnohých proteínoch.Všetky tri vyhľadávania v Dali vrátili iba jeden výsledok: IZUMO1.
Dlho sa predpokladalo, že SPACA6 a IZUMO1 zdieľajú štrukturálne podobnosti7,32,37.Hoci ektodomény týchto dvoch proteínov spojených s fúziou gamét zdieľajú iba 21% sekvenčnú identitu (obrázok S8a), komplexný dôkaz, vrátane vzoru konzervovaných disulfidových väzieb a predpovedanej C-terminálnej domény podobnej Ig v SPACA6, umožnil skoré pokusy vybudovať homologický model myši A a SPACA6 s použitím IZUMO1 ako templátu37.Naša štruktúra potvrdzuje tieto predpovede a ukazuje skutočný stupeň podobnosti.V skutočnosti štruktúry SPACA6 a IZUMO137,43,44 zdieľajú rovnakú architektúru dvoch domén (obr. S8b) s podobnými 4HB a Ig podobnými β-sendvičovými doménami spojenými kĺbovou oblasťou (obr. S8c).
IZUMO1 a SPACA6 4HB majú spoločné rozdiely od bežných špirálových zväzkov.Typické 4HB, ako tie, ktoré sa nachádzajú v proteínových komplexoch SNARE zapojených do endozomálnej fúzie 45, 46, majú rovnomerne rozmiestnené helixy udržiavajúce konštantné zakrivenie okolo centrálnej osi 47. Na rozdiel od toho, špirálové domény v IZUMO1 aj SPACA6 boli skreslené s premenlivým zakrivením a nerovnomerné balenie (obrázok S8d).Skrútenie, pravdepodobne spôsobené trojuholníkom tvoreným špirálami 1', 1 a 2, je zachované v IZUMO1 a SPACA6 a stabilizované rovnakým motívom CXXC na špirále 1'.Avšak dodatočná disulfidová väzba nachádzajúca sa v SPACA6 (Cys41 a Cys55 kovalentne spájajúce špirály 1 a 2 vyššie) vytvára ostrejší vrchol na vrchole trojuholníka, vďaka čomu je SPACA6 viac skrútený ako IZUMO1, s výraznejšími dutinovými trojuholníkmi.Okrem toho IZUMO1 nemá Arg37 pozorovaný v strede tejto dutiny v SPACA6.Na rozdiel od toho má IZUMO1 typickejšie hydrofóbne jadro z alifatických a aromatických zvyškov.
IZUMO1 má doménu podobnú Ig pozostávajúcu z dvojvláknového a päťvláknového β-listu43.Dodatočné vlákno v IZUMO1 nahrádza cievku v SPACA6, ktorá interaguje s vláknom F, aby obmedzila vodíkové väzby hlavného reťazca vo vlákne.Zaujímavým bodom porovnania je predpokladaný povrchový náboj Ig-podobných domén týchto dvoch proteínov.Povrch IZUMO1 je zápornejšie nabitý ako povrch SPACA6.Ďalší náboj sa nachádza v blízkosti C-konca smerujúceho k membráne spermií.V SPACA6 boli rovnaké oblasti neutrálnejšie alebo kladne nabité (obr. S8e).Napríklad hydrofóbny povrch (tenšie okraje) a kladne nabité jamky (širšie okraje) v SPACA6 sú v IZUMO1 negatívne nabité.
Hoci vzťah a sekundárne štruktúrne prvky medzi IZUMO1 a SPACA6 sú dobre zachované, štrukturálne zarovnanie Ig-podobných domén ukázalo, že tieto dve domény sa líšia vo svojej všeobecnej orientácii voči sebe navzájom (obr. S9).Špirálový zväzok IZUMO1 je zakrivený okolo β-sendviča, čím vytvára skôr opísaný tvar „bumerangu“ približne 50° od stredovej osi.Na rozdiel od toho bol špirálový lúč v SPACA6 naklonený asi 10 ° v opačnom smere.Rozdiely v týchto orientáciách sú pravdepodobne spôsobené rozdielmi v oblasti pántu.Na úrovni primárnej sekvencie zdieľajú IZUMO1 a SPACA6 malú sekvenčnú podobnosť na pánte, s výnimkou zvyškov cysteínu, glycínu a kyseliny asparágovej.V dôsledku toho sú vodíkové väzby a elektrostatické siete úplne odlišné.Prvky sekundárnej štruktúry β-listu zdieľajú IZUMO1 a SPACA6, hoci reťazce v IZUMO1 sú oveľa dlhšie a 310 špirála (helix 5) je jedinečná pre SPACA6.Tieto rozdiely vedú k rôznym orientáciám domén pre dva inak podobné proteíny.
Naše vyhľadávanie na serveri Dali odhalilo, že SPACA6 a IZUMO1 sú jediné dve experimentálne určené štruktúry uložené v proteínovej databáze, ktoré majú tento konkrétny 4HB násobok (tabuľka S1).Nedávno DeepMind (Alphabet/Google) vyvinul AlphaFold, systém založený na neurónovej sieti, ktorý dokáže presne predpovedať 3D štruktúry proteínov z primárnych sekvencií48.Krátko potom, čo sme vyriešili štruktúru SPACA6, bola uvoľnená databáza AlphaFold, ktorá poskytuje modely prediktívnej štruktúry pokrývajúce 98,5 % všetkých proteínov v ľudskom proteóme48,49.Použitím našej vyriešenej štruktúry SPACA6 ako vyhľadávacieho modelu, hľadanie štruktúrnej homológie pre model v ľudskom proteóme AlphaFold identifikovalo kandidátov s možnými štrukturálnymi podobnosťami s SPACA6 a IZUMO1.Vzhľadom na neuveriteľnú presnosť AlphaFold pri predpovedaní SPACA6 (obr. S10a) – najmä ektodomény 1,1 Å rms v porovnaní s našou vyriešenou štruktúrou (obr. S10b) – si môžeme byť istí, že identifikované zhody SPACA6 budú pravdepodobne presné.
Predtým PSI-BLAST hľadal klaster IZUMO1 s tromi ďalšími proteínmi spojenými so spermiami: IZUMO2, IZUMO3 a IZUMO450.AlphaFold predpovedal, že tieto proteíny rodiny IZUMO sa skladajú do domény 4HB s rovnakým vzorom disulfidových väzieb ako IZUMO1 (obrázky 3a a S11), hoci im chýba doména podobná Ig.Predpokladá sa, že IZUMO2 a IZUMO3 sú jednostranné membránové proteíny podobné IZUMO1, zatiaľ čo IZUMO4 sa zdá byť vylučovaný.Funkcie proteínov IZUMO 2, 3 a 4 vo fúzii gamét neboli stanovené.Je známe, že IZUMO3 hrá úlohu v biogenéze akrozómov počas vývoja spermií51 a zistilo sa, že proteín IZUMO tvorí komplex50.Konzervácia proteínov IZUMO u cicavcov, plazov a obojživelníkov naznačuje, že ich potenciálna funkcia je v súlade s funkciou iných známych proteínov spojených s fúziou gamét, ako sú DCST1/2, SOF1 a FIMP.
Diagram architektúry domény nadrodiny IST so 4HB, pántom a doménami podobnými Ig zvýraznenými oranžovou, zelenou a modrou farbou.IZUMO4 má jedinečnú oblasť C-konca, ktorá vyzerá ako čierna.Potvrdené a predpokladané disulfidové väzby sú znázornené plnými a bodkovanými čiarami.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F1) a AlphaTMEMold DB: AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q3KNT9-F1) sú zobrazené v rovnakom farebnom rozsahu ako panel A. Disulfidové väzby sú zobrazené purpurovou farbou.Transmembránové špirály TMEM95, IZUMO2 a IZUMO3 nie sú zobrazené.
Na rozdiel od proteínu IZUMO sa iné proteíny SPACA (tj SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5 a SPACA9) považujú za štrukturálne odlišné od SPACA6 (obr. S12).Iba SPACA9 má 4HB, ale neočakáva sa, že bude mať rovnakú paralelnú antiparalelnú orientáciu alebo rovnakú disulfidovú väzbu ako SPACA6.Iba SPACA1 má podobnú doménu podobnú Ig.AlphaFold predpovedá, že SPACA3, SPACA4 a SPACA5 majú úplne inú štruktúru ako SPACA6.Je zaujímavé, že SPACA4 je tiež známy tým, že hrá úlohu pri oplodnení, ale vo väčšej miere ako SPACA6, namiesto toho uľahčuje interakciu medzi spermiami a oocytovou zónou pellucida52.
Naše vyhľadávanie AlphaFold našlo ďalšiu zhodu pre IZUMO1 a SPACA6 4HB, TMEM95.TMEM95, jediný transmembránový proteín špecifický pre spermie, spôsobuje, že samce myší sú po ablácii neplodné 32,33.Spermie, ktorým chýba TMEM95, mali normálnu morfológiu, pohyblivosť a schopnosť prenikať do zona pellucida a viazať sa na membránu vajíčka, ale nemohli fúzovať s membránou oocytov.Predchádzajúce štúdie ukázali, že TMEM95 zdieľa štrukturálne podobnosti s IZUMO133.Model AlphaFold skutočne potvrdil, že TMEM95 je 4HB s rovnakým párom motívov CXXC ako IZUMO1 a SPACA6 a rovnakou ďalšou disulfidovou väzbou medzi špirálami 1 a 2, ktoré sa nachádzajú v SPACA6 (obr. 3a a S11).Hoci TMEM95 nemá Ig-podobnú doménu, má oblasť so vzorom disulfidových väzieb podobným pántovým oblastiam SPACA6 a IZUMO1 (obr. 3b).V čase zverejnenia tohto rukopisu predtlačový server informoval o štruktúre TMEM95, čím sa potvrdil výsledok AlphaFold53.TMEM95 je veľmi podobný SPACA6 a IZUMO1 a je evolučne konzervovaný už u obojživelníkov (obr. 4 a S13).
Vyhľadávanie PSI-BLAST využívalo databázy NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP a SOF1 na určenie polohy týchto sekvencií v strome života.Vzdialenosti medzi bodmi odbočiek nie sú zobrazené v mierke.
Nápadná celková štrukturálna podobnosť medzi SPACA6 a IZUMO1 naznačuje, že sú zakladajúcimi členmi konzervovanej štrukturálnej nadrodiny, ktorá zahŕňa proteíny TMEM95 a IZUMO 2, 3 a 4.známi členovia: IZUMO1, SPACA6 a TMEM95.Pretože iba niekoľko členov má domény podobné Ig, charakteristickým znakom nadrodiny IST je doména 4HB, ktorá má jedinečné vlastnosti spoločné pre všetky tieto proteíny: 1) Zvinutý 4HB so špirálami usporiadanými v antiparalelnom/paralelnom striedaní (obr. 5a), 2) zväzok má trojuholníkovú plochu pozostávajúcu z dvoch helixov vo zväzku a tretej vertikálnej špirály (obr. kľúčová oblasť (obr. 5c). Je známe, že motív CXXC, ktorý sa nachádza v proteínoch podobných tioredoxínu, funguje ako redoxný senzor54,55,56, zatiaľ čo motív v členoch rodiny IST môže byť spojený s proteínovými disulfidovými izomerázami, ako je ERp57 vo fúzii gamét.Úlohy sú spojené 57,58.
Členovia nadrodiny IST sú definovaní tromi charakteristickými znakmi domény 4HB: štyrmi špirálami striedajúcimi sa medzi paralelnou a antiparalelnou orientáciou, ba-trojuholníkové helikálne strany zväzku a dvojitý motív ca CXXC vytvorený medzi malými molekulami.) N-koncové špirály (oranžové) a pántová oblasť β-vlásenka (zelená).
Vzhľadom na podobnosť medzi SPACA6 a IZUMO1 bola testovaná schopnosť prvého viazať sa na IZUMO1 alebo JUNO.Biovrstvová interferometria (BLI) je kinetická väzbová metóda, ktorá sa predtým používala na kvantifikáciu interakcie medzi IZUMO1 a JUNO.Po inkubácii biotínom značeného senzora s IZUMO1 ako návnadou s vysokou koncentráciou analytu JUNO bol detegovaný silný signál (obr. S14a), čo naznačuje väzbou indukovanú zmenu hrúbky biomateriálu pripevneného na hrot senzora.Podobné signály (tj JUNO spojený so senzorom ako návnada proti analytu IZUMO1) (obr. S14b).Keď sa SPACA6 použil ako analyt proti IZUMO1 viazanému na senzor alebo JUNO viazanému na senzor (obrázok S14a, b), nezistil sa žiadny signál.Neprítomnosť tohto signálu naznačuje, že extracelulárna doména SPACA6 neinteraguje s extracelulárnou doménou IZUMO1 alebo JUNO.
Pretože test BLI je založený na biotinylácii voľných lyzínových zvyškov na návnadovom proteíne, táto modifikácia môže zabrániť väzbe, ak sú do interakcie zapojené lyzínové zvyšky.Okrem toho orientácia väzby vzhľadom na senzor môže vytvárať stérické prekážky, takže konvenčné pull-down testy sa uskutočňovali aj na rekombinantných ektodoménach SPACA6, IZUMO1 a JUNO.Napriek tomu sa SPACA6 nezrážal s His-značeným IZUMO1 alebo His-značeným JUNO (obr. S14c,d), čo naznačuje žiadnu interakciu v súlade s tým, čo bolo pozorované v BLI experimentoch.Ako pozitívnu kontrolu sme potvrdili interakciu JUNO s označeným His IZUMO1 (obrázky S14e a S15).
Napriek štrukturálnej podobnosti medzi SPACA6 a IZUMO1 nie je prekvapujúca neschopnosť SPACA6 viazať JUNO.Povrch ľudského IZUMO1 má viac ako 20 zvyškov, ktoré interagujú s JUNO, vrátane zvyškov z každej z troch oblastí (hoci väčšina z nich sa nachádza v pántovej oblasti) (obr. S14f).Z týchto zvyškov je iba jeden konzervovaný v SPACA6 (Glu70).Zatiaľ čo mnohé substitúcie zvyškov si zachovali svoje pôvodné biochemické vlastnosti, esenciálny zvyšok Arg160 v IZUMO1 bol nahradený negatívne nabitým Asp148 v SPACA6;predchádzajúce štúdie ukázali, že mutácia Arg160Glu v IZUMO1 takmer úplne ruší väzbu na JUNO43.Okrem toho rozdiel v orientácii domény medzi IZUMO1 a SPACA6 významne zvýšil povrchovú plochu JUNO-väzbového miesta ekvivalentnej oblasti na SPACA6 (obr. S14g).
Napriek známej potrebe SPACA6 na fúziu gamét a jeho podobnosti s IZUMO1 sa nezdá, že SPACA6 má ekvivalentnú väzbovú funkciu JUNO.Preto sme sa snažili skombinovať naše štrukturálne údaje s dôkazmi dôležitosti, ktoré poskytuje evolučná biológia.Zoradenie sekvencií homológov SPACA6 ukazuje zachovanie spoločnej štruktúry mimo cicavcov.Napríklad cysteínové zvyšky sú prítomné aj u vzdialene príbuzných obojživelníkov (obr. 6a).Pomocou servera ConSurf boli na povrch SPACA6 mapované údaje o zadržaní viacerých sekvencií 66 sekvencií.Tento typ analýzy môže ukázať, ktoré zvyšky sa zachovali počas evolúcie proteínu, a môže naznačiť, ktoré povrchové oblasti zohrávajú úlohu vo funkcii.
a Zoradenie sekvencií ektodomén SPACA6 z 12 rôznych druhov pripravených s použitím CLUSTAL OMEGA.Podľa analýzy ConSurf sú najkonzervatívnejšie pozície označené modrou farbou.Zvyšky cysteínu sú zvýraznené červenou farbou.Hranice domén a prvky sekundárnej štruktúry sú zobrazené v hornej časti zarovnania, kde šípky označujú β-reťazce a vlny označujú skrutkovice.Prístupové identifikátory NCBI obsahujúce tieto sekvencie sú: človek (Homo sapiens, NP_001303901), mandril (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), kapucínska opica (napodobňovač Cebus, XP_017359366), kôň (Equus khal052053) 3_23 XP_032_034) .), ovca (Ovis aries, XP_014955560), slon (Loxodonta africana, XP_010585293), pes (Canis lupus familyis, XP_025277208), myš (Mus musculus, NP_001156381), XP_03618 čert, XP_036181us diabol ), Platypus, 8) , 61_89 a Bullfrog (Bufo bufo, XP_040282113).Číslovanie je založené na ľudskom poriadku.b Povrchová reprezentácia štruktúry SPACA6 so 4HB v hornej časti a doménou podobnou Ig v spodnej časti, farby založené na odhadoch zachovania zo servera ConSurf.Najzachovalejšie časti sú v modrej farbe, stredne zachované časti v bielej farbe a najmenej zachované v žltej farbe.fialový cysteín.Tri povrchové náplasti demonštrujúce vysokú úroveň ochrany sú zobrazené vo vložke označenej náplasti 1, 2 a 3. Vo vložke vpravo hore je zobrazená karikatúra 4HB (rovnaká farebná schéma).
Štruktúra SPACA6 má tri vysoko konzervované povrchové oblasti (obr. 6b).Patch 1 pokrýva 4HB a pántovú oblasť a obsahuje dva konzervované CXXC disulfidové mostíky, pántovú sieť Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 (obr. S7) a tri konzervované vonkajšie aromatické zvyšky (Phe31, Tyr73, Phe137)).širší okraj Ig-like domény (obr. S6e), ktorý predstavuje niekoľko kladne nabitých zvyškov na povrchu spermií.Je zaujímavé, že táto náplasť obsahuje protilátkový epitop, o ktorom sa predtým ukázalo, že interferuje s funkciou SPACA6 30.Oblasť 3 preklenuje pánt a jednu stranu Ig-podobnej domény;táto oblasť obsahuje konzervované prolíny (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) a smerom von smerujúce polárne/nabité zvyšky.Prekvapivo, väčšina zvyškov na povrchu 4HB je vysoko variabilná (obr. 6b), aj keď fold je zachovaný v celom homológu SPACA6 (ako je naznačené konzervativizmom hydrofóbneho jadra zväzku) a mimo nadrodiny IST.
Aj keď ide o najmenšiu oblasť v SPACA6 s najmenším počtom detegovateľných prvkov sekundárnej štruktúry, mnoho zvyškov pántovej oblasti (vrátane oblasti 3) je medzi homológmi SPACA6 vysoko konzervovaných, čo môže naznačovať, že orientácia špirálového zväzku a β-sendviča hrá úlohu.ako konzervatívec.Avšak napriek rozsiahlym vodíkovým väzbám a elektrostatickým sieťam v pántovej oblasti SPACA6 a IZUMO1 je možné vidieť dôkaz vnútornej flexibility v zarovnaní viacerých povolených štruktúr IZUMO137,43,44.Zarovnanie jednotlivých domén sa dobre prekrývalo, ale orientácia domén voči sebe sa pohybovala od 50° do 70° od centrálnej osi (obr. S16).Na pochopenie konformačnej dynamiky SPACA6 v roztoku boli vykonané experimenty SAXS (obr. S17a,b).Ab initio rekonštrukcia ektodomény SPACA6 zodpovedala štruktúre kryštálov tyčinky (obr. S18), aj keď Kratkyho graf ukázal určitý stupeň flexibility (obr. S17b).Táto konformácia je v kontraste s IZUMO1, v ktorom nenaviazaný proteín nadobúda tvar bumerangu v mriežke aj v roztoku43.
Na špecifickú identifikáciu flexibilnej oblasti sa uskutočnila hmotnostná spektroskopia výmeny vodíka a deutéria (H-DXMS) na SPACA6 a porovnala sa s údajmi predtým získanými na IZUMO143 (obr. 7a, b).SPACA6 je jednoznačne flexibilnejší ako IZUMO1, o čom svedčí vyššia výmena deutéria v celej štruktúre po 100 000 s výmeny.V oboch štruktúrach vykazuje C-terminálna časť pántovej oblasti vysokú úroveň výmeny, čo pravdepodobne umožňuje obmedzenú rotáciu 4HB a Ig-podobných domén voči sebe navzájom.Je zaujímavé, že C-koncová časť pántu SPACA6, pozostávajúca zo zvyšku 147CDLPLDCP154, je vysoko konzervovanou oblasťou 3 (obr. 6b), čo pravdepodobne naznačuje, že medzidoménová flexibilita je evolučne zachovaná vlastnosť SPACA6.Podľa analýzy flexibility, údaje o tepelnej tavenine CD ukázali, že SPACA6 (Tm = 51,2 °C) je menej stabilný ako IZUMO1 (Tm = 62,9 °C) (obr. S1e a S19).
a H-DXMS obrázky SPACA6 a b IZUMO1.Percento výmeny deutéria bolo stanovené v uvedených časových bodoch.Úrovne výmeny vodík-deutérium sú označené farbou na stupnici od modrej (10 %) po červenú (90 %).Čierne skrinky predstavujú oblasti s vysokou výmenou.Hranice 4HB, pántu a Ig-podobnej domény pozorované v kryštálovej štruktúre sú zobrazené nad primárnou sekvenciou.Úrovne výmeny deutéria pri 10 s, 1 000 s a 100 000 s boli vynesené na pásovom diagrame superponovanom na priehľadné molekulárne povrchy SPACA6 a IZUMO1.Časti štruktúr s úrovňou výmeny deutéria pod 50 % sú zafarbené na bielo.Oblasti nad 50 % výmeny H-DXMS sú zafarbené v stupnici gradientu.
Použitie genetických stratégií CRISPR/Cas9 a knockout myších génov viedlo k identifikácii niekoľkých faktorov dôležitých pre väzbu a fúziu spermií a vajíčok.Okrem dobre charakterizovanej interakcie IZUMO1-JUNO a štruktúry CD9 zostáva väčšina proteínov spojených s fúziou gamét štrukturálne a funkčne záhadná.Biofyzikálna a štrukturálna charakterizácia SPACA6 je ďalším kúskom molekulárnej skladačky adhézie/fúzie počas oplodnenia.
Zdá sa, že SPACA6 a ďalší členovia nadrodiny IST sú vysoko konzervované u cicavcov, ako aj u jednotlivých vtákov, plazov a obojživelníkov;v skutočnosti sa predpokladá, že SPACA6 je dokonca potrebný na oplodnenie u zebričiek 59. Táto distribúcia je podobná iným známym proteínom spojeným s fúziou gamét, ako sú DCST134, DCST234, FIMP31 a SOF132, čo naznačuje, že tieto faktory sú HAP2-deficientné (tiež známe ako GCS1) proteíny, ktoré sú zodpovedné za katalytickú aktivitu mnohých protistov., rastliny a článkonožce.Oplodnené fúzne proteíny 60, 61. Napriek silnej štruktúrnej podobnosti medzi SPACA6 a IZUMO1, knockout génov kódujúcich ktorýkoľvek z týchto proteínov viedol k neplodnosti u samcov myší, čo naznačuje, že ich funkcie pri fúzii gamét nie sú duplikované..V širšom zmysle, žiadny zo známych spermií potrebných pre adhéznu fázu fúzie nie je nadbytočný.
Zostáva otvorenou otázkou, či sa SPACA6 (a ďalší členovia superrodiny IST) zúčastňujú na intergametických spojeniach, vytvárajú intragametické siete na získavanie dôležitých proteínov do fúznych bodov alebo možno dokonca pôsobia ako nepolapiteľné fuzogény.Štúdie koimunoprecipitácie v bunkách HEK293T odhalili interakciu medzi IZUMO1 v plnej dĺžke a SPACA632.Naše rekombinantné ektodomény však neinteragovali in vitro, čo naznačuje, že interakcie pozorované v Noda et al.boli obe vymazané v konštrukte (všimnite si cytoplazmatický chvost IZUMO1, ktorý sa ukázal ako nepotrebný na oplodnenie62).Alternatívne môžu IZUMO1 a/alebo SPACA6 vyžadovať špecifické väzbové prostredia, ktoré nereprodukujeme in vitro, ako sú fyziologicky špecifické konformácie alebo molekulárne komplexy obsahujúce iné proteíny (známe alebo ešte neobjavené).Hoci sa predpokladá, že ektodoména IZUMO1 sprostredkuje pripojenie spermií k vajíčku v perivitelínovom priestore, účel ektodomény SPACA6 je nejasný.
Štruktúra SPACA6 odhaľuje niekoľko konzervovaných povrchov, ktoré sa môžu podieľať na interakciách proteín-proteín.Konzervovaná časť pántovej oblasti bezprostredne susediaca s motívom CXXC (označená ako Patch 1 vyššie) má niekoľko von smerujúcich aromatických zvyškov, ktoré sú často spojené s hydrofóbnymi a π-skladovacími interakciami medzi biomolekulami.Široké strany Ig-podobnej domény (oblasť 2) tvoria kladne nabitú drážku s vysoko konzervovanými zvyškami Arg a His a protilátky proti tejto oblasti sa predtým používali na blokovanie fúzie gamét30.Protilátka rozpoznáva lineárny epitop 212RIRPAQLTHRGTFS225, ktorý má tri zo šiestich arginínových zvyškov a vysoko konzervovaný His220.Nie je jasné, či je dysfunkcia spôsobená blokádou týchto špecifických zvyškov alebo celej oblasti.Umiestnenie tejto medzery blízko C-konca β-sendviča naznačuje cis-interakcie so susednými spermálnymi proteínmi, ale nie s oocytovými proteínmi.Okrem toho retencia vysoko flexibilnej spleti bohatej na prolín (miesto 3) v pánte môže byť miestom interakcie proteín-proteín alebo, čo je pravdepodobnejšie, môže naznačovať zachovanie flexibility medzi týmito dvoma doménami.Pohlavie je dôležité pre neznámu úlohu SPACA6.fúzia gamét.
SPACA6 má vlastnosti medzibunkových adhéznych proteínov, vrátane Ig-podobných β-sendvičov.Mnohé adhezívne proteíny (napr. kadheríny, integríny, adhezíny a IZUMO1) majú jednu alebo viacero β-sendvičových domén, ktoré predlžujú proteíny z bunkovej membrány k ich environmentálnym cieľom63,64,65.Doména podobná Ig SPACA6 obsahuje aj motív bežne sa vyskytujúci v β-sendvičoch adhézie a súdržnosti: dublety paralelných vlákien na koncoch β-sendvičov, známe ako mechanické svorky66.Predpokladá sa, že tento motív zvyšuje odolnosť voči šmykovým silám, čo je cenné pre proteíny zapojené do medzibunkových interakcií.Napriek tejto podobnosti s adhezínmi však v súčasnosti neexistuje žiadny dôkaz, že SPACA6 interaguje s vaječnými bielkami.Ektodoména SPACA6 nie je schopná viazať sa na JUNO a bunky HEK293T exprimujúce SPACA6, ako je tu ukázané, sotva interagujú s oocytmi, ktorým chýba zóna 32.Ak SPACA6 vytvorí medzigametické väzby, tieto interakcie môžu vyžadovať posttranslačné modifikácie alebo môžu byť stabilizované inými spermiami.Na podporu druhej hypotézy sa spermie s deficitom IZUMO1 viažu na oocyty, čo dokazuje, že v kroku adhézie gamét sú zapojené aj iné molekuly ako IZUMO1.
Mnohé vírusové, bunkové a vývojové fúzne proteíny majú vlastnosti, ktoré predpovedajú ich funkciu ako fuzogénov.Napríklad vírusové fúzne glykoproteíny (triedy I, II a III) majú hydrofóbny fúzny peptid alebo slučku na konci proteínu, ktorý je vložený do hostiteľskej membrány.Mapa hydrofilnosti IZUMO143 a štruktúra (určená a predpovedaná) nadrodiny IST nevykazovala žiadny zjavný hydrofóbny fúzny peptid.Ak teda nejaké proteíny v superrodine IST fungujú ako fúzogény, robia to spôsobom odlišným od iných známych príkladov.
Záverom možno povedať, že funkcie členov nadrodiny proteínov IST spojených s fúziou gamét zostávajú vzrušujúcim tajomstvom.Naša charakterizovaná rekombinantná molekula SPACA6 a jej rozlíšená štruktúra poskytne pohľad na vzťahy medzi týmito zdieľanými štruktúrami a ich úlohu pri pripájaní a fúzii gamét.
Sekvencia DNA zodpovedajúca predpovedanej ľudskej ektodoméne SPACA6 (prírastkové číslo NCBI NP_001303901.1; zvyšky 27–246) bola kodónovo optimalizovaná na expresiu v bunkách Drosophila melanogaster S2 a syntetizovaná ako génový fragment so sekvenciou kódujúcou Kozak (Eurofins Genomics).sekrečný signál BiP a zodpovedajúce 5' a 3' konce pre klonovanie tohto génu nezávislé od ligácie do expresného vektora pMT na báze metalotioneínového promótora modifikovaného na selekciu puromycínom (pMT-puro).Vektor pMT-puro kóduje miesto štiepenia trombínom, po ktorom nasleduje 10x-His C-terminálny tag (obrázok S2).
Stabilná transfekcia vektora SPACA6 pMT-puro do buniek D. melanogaster S2 (Gibco) sa uskutočnila podobne ako v protokole použitom pre IZUMO1 a JUNO43.Bunky S2 boli rozmrazené a pestované v Schneiderovom médiu (Gibco) doplnenom 10 % (obj./obj.) tepelne inaktivovaným fetálnym teľacím sérom (Gibco) a IX antimykotickým antibiotikom (Gibco).Bunky skorej pasáže (3,0 x 106 buniek) sa umiestnili do jednotlivých jamiek 6-jamkových doštičiek (Corning).Po 24 hodinách inkubácie pri 27 °C boli bunky transfekované zmesou 2 mg SPACA6 pMT-puro vektora a Effectene transfekčného činidla (Qiagen) podľa protokolu výrobcu.Transfekované bunky sa inkubovali 72 hodín a potom sa zozbierali s 6 mg/ml puromycínu.Bunky sa potom izolovali z kompletného Schneiderovho média a umiestnili sa do média Insect-XPRESS bez séra (Lonza) na produkciu proteínov vo veľkom meradle.1 1 dávka bunkovej kultúry S2 sa pestovala na 8–10 x 106 ml-1 buniek v 2 l ventilovanej polypropylénovej Erlenmeyerovej banke s plochým dnom a potom sa sterilizovala s konečnou koncentráciou 500 uM CuSO4 (Millipore Sigma) a sterilne sa prefiltrovala.vyvolané.Indukované kultúry sa inkubovali pri 27 °C pri 120 otáčkach za minútu počas štyroch dní.
Kondicionované médium obsahujúce SPACA6 sa izolovalo centrifugáciou pri 5660 x g pri 4 °C a následne filtračným systémom Centramate s tangenciálnym prietokom (Pall Corp) s 10 kDa MWCO membránou.Naneste koncentrované médium obsahujúce SPACA6 na 2 ml kolónu Ni-NTA agarózovej živice (Qiagen).Živica Ni-NTA sa premyla 10 objemami kolóny (CV) pufra A a potom sa pridal 1 CV pufra A, čím sa získala konečná koncentrácia imidazolu 50 mM.SPACA6 sa eluoval 10 ml pufra A doplneného imidazolom na konečnú koncentráciu 500 mM.Trombín reštrikčnej triedy (Millipore Sigma) sa pridal priamo do dialyzačnej hadičky (MWCO 12-14 kDa) v množstve 1 jednotka na mg SPACA6 oproti 1 1 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 a 150 mM NaCI (pufor B) na dialýzu.) pri 4 °C počas 48 hodín.Trombínom štiepený SPACA6 sa potom trikrát zriedil, aby sa znížila koncentrácia soli, a naniesol sa na 1 ml MonoS 5/50 GL katexovú kolónu (Cytiva/GE) ekvilibrovanú 10 mM Tris-HCl, pH 7,5.Katiónový menič sa premyl 3 CV 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, potom sa SPACA6 eluoval lineárnym gradientom 0 až 500 mM NaCI v 10 mM Tris-HCI, pH 7,5 počas 25 CV.Po iónomeničovej chromatografii sa SPACA6 koncentroval na 1 ml a eluoval sa izokraticky z ENrich SEC650 10 x 300 kolóny (BioRad) ekvilibrovanej pufrom B. Podľa chromatogramu sa spojili a koncentrovali frakcie obsahujúce SPACA6.Čistota sa kontrolovala elektroforézou farbenou Coomassie na 16% SDS-polyakrylamidovom géli.Koncentrácia proteínu bola kvantifikovaná absorbanciou pri 280 nm použitím Beer-Lambertovho zákona a teoretického molárneho extinkčného koeficientu.
Purifikovaný SPACA6 bol cez noc dialyzovaný proti 10 mM fosforečnanu sodnému, pH 7,4 a 150 mM NaF a pred analýzou pomocou CD spektroskopie zriedený na 0,16 mg/ml.Spektrálne skenovanie CD s vlnovou dĺžkou 185 až 260 nm sa zbieralo na spektropolarimetri Jasco J-1500 s použitím kremenných kyviet s dĺžkou optickej dráhy 1 mm (Helma) pri 25 °C rýchlosťou 50 nm/min.CD spektrá boli korigované na základnú čiaru, spriemerované z 10 akvizícií a konvertované na strednú zvyškovú elipticitu (θMRE) v stupňoch cm2/dmol:
kde MW je molekulová hmotnosť každej vzorky v Da;N je počet aminokyselín;θ je elipticita v miligramoch;d zodpovedá dĺžke optickej dráhy v cm;koncentrácia bielkovín v jednotkách.