310 10*1mm Chemická zložka špirálových hadičiek z nehrdzavejúcej ocele N-koncové domény spidroínu tvoria hydrogély na báze amyloidných fibríl a poskytujú platformu na imobilizáciu proteínov.

Ďakujeme, že ste navštívili Nature.com.Používate verziu prehliadača s obmedzenou podporou CSS.Pre najlepší zážitok vám odporúčame použiť aktualizovaný prehliadač (alebo vypnúť režim kompatibility v programe Internet Explorer).Okrem toho, aby sme zabezpečili nepretržitú podporu, zobrazujeme stránku bez štýlov a JavaScriptu.
Posúvače zobrazujúce tri články na snímke.Na posúvanie medzi snímkami použite tlačidlá späť a ďalej, na posúvanie sa po jednotlivých snímkach použite tlačidlá ovládača posúvania na konci.

Špecifikácia

310 Dodávatelia špirálových rúrok z nehrdzavejúcej ocele 10 * 1 mm

Chemické zloženie

Mechanické vlastnosti

Rekombinantné proteíny pavúčieho hodvábu (proteíny pavúčieho hodvábu) majú veľa potenciálnych aplikácií pri vývoji nových biomateriálov, ale ich multimodálna povaha a náchylnosť k agregácii sťažuje ich získanie a jednoduché použitie.Tu uvádzame, že rekombinantné miniatúrne spidroínové proteíny a, čo je dôležité, samotná N-terminálna doména (NT) rýchlo tvoria samonosné a transparentné hydrogély pri 37 ° C.fúzne proteíny pozostávajúce z NT a zeleného fluorescenčného proteínu alebo purínovej nukleozidfosforylázy tvoria plne funkčné fúzne proteíny.Hydrogély.Naše výsledky ukazujú, že rekombinantné NT a fúzne proteíny poskytujú vysoké výťažky expresie a poskytujú hydrogélom atraktívne vlastnosti, ako je priehľadnosť, gélovatenie bez zosieťovania a priama imobilizácia aktívnych proteínov pri vysokej hustote.
Pavúky majú až sedem rôznych sád hodvábnych žliaz, z ktorých každá produkuje špecifický typ hodvábu.Všetkých sedem druhov hodvábu sa skladá z proteínov pavúčieho hodvábu (spidroins) dlhých približne 6000 zvyškov a obsahuje veľkú centrálnu opakujúcu sa oblasť obklopenú sférickými N- a C-terminálnymi doménami (NT a CT)1,2.Najviac študovaný typ hodvábu, primárna ampulka, je produkovaná primárnou ampulkou.V tejto žľaze monovrstva epitelových buniek syntetizuje spidroínové proteíny a vylučuje ich do lúmenu žľazy, kde sú prítomné v rozpustnej forme (doping) v extrémne vysokých koncentráciách (30–50 % w/v)3,4.O organizácii a konformácii hlavných ampulárnych spidroínových proteínov v žľaze sa diskutovalo, ale väčšina experimentálnych dôkazov naznačuje prítomnosť všeobecne helikálnej a/alebo náhodnej helikálnej konformácie a micelárnych alebo lamelárnych štruktúr5,6,7,8,9,10.Zatiaľ čo opakujúce sa domény regulujú mechanické vlastnosti hodvábnych vlákien, tvoria nanokryštály β-listu a amorfné štruktúry11,12,13,14,15, koncové domény regulujú hodvábne vlákna v reakcii na meniace sa podmienky pozdĺž hodvábnej žľazy16,17,18.Riadením tvorby hodvábu sú 19. Terminálne domény evolučne konzervované a ich funkcia môže byť spoločná pre všetky spidroínové proteíny 2,20,21.Počas prechodu žľazou pH spidroínu klesá z približne 7,6 na < 5,716 a zvyšuje sa strihom a naťahovaním sprostredkovaným pohybom cez postupne sa zužujúci kanálik.V roztoku je CT α-helikálny konštitutívny paralelný dimér17, ale v reakcii na nízke pH a šmykové sily sa CT rozvinie a prepne β-vrstvy16, 17, čo pravdepodobne spustí β-vrstvy v opakujúcich sa oblastiach Convert 16. NT sú monomérne pod podmienky odzrkadľujúce podmienky v lúmene žľazy a sprostredkúvajú rozpustnosť spidroínu, ale pri zníženom pH vedie protonácia množstva bočných reťazcov karboxylových kyselín k dimerizácii NT s pKa približne 6,5, čím sa stabilizuje NT a fixuje sa spidroín vo veľkom množstvá.siete16,18.NT teda hrá kľúčovú úlohu pri tvorbe filamentov, pričom sa mení z monoméru v povlaku na dimér vo vlákne23,24,25.NT zostáva vysoko rozpustný a špirálovitý za všetkých doteraz študovaných podmienok16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29, čo inšpirovalo jeho vývoj ako značky zvyšujúcej rozpustnosť na produkciu heterológnych proteínov.
Rekombinantný mini proteín pavúčieho hodvábu, pozostávajúci z jedného NT, jednej krátkej opakujúcej sa oblasti, jedného CT a značky His6 (His-NT2RepCT) na čistenie, je rozpustný vo vodnom tlmivom roztoku rovnako ako natívny proteín pavúčieho hodvábu a napodobňuje prirodzené dôležité vlastnosti hodvábneho pavúka. .pokrytie 25.31.His-NT2RepCT možno spriadať na kontinuálne vlákna pomocou biomimetického stroja, v ktorom je rozpustný povlak s pH 8 extrudovaný do vodného kúpeľa s pH 525,32,33,34,35.Fermentácia E. coli exprimujúca His-NT2RepCT v bioreaktore a následné spracovanie viedli k výťažku >14 g/l po čistení.Vysoký výťažok, vysoká rozpustnosť a primeraná reakcia His-NT2RepCT na kyslé podmienky sa pripisujú NT23, 25, 34.
Tu uvádzame rýchlu tvorbu transparentných hydrogélov z rekombinantných spidroínových proteínov, vrátane samotného NT, inkubáciou proteínového roztoku pri 37 ° C.Pomocou fluorescencie tioflavínu T (ThT), infračervenej spektroskopie s Fourierovou transformáciou (FTIR), nukleárnej magnetickej rezonančnej spektroskopie (NMR) a transmisnej elektrónovej mikroskopie (TEM) sme zistili, že proteíny NT a mikropavúkov podliehajú štruktúrnej transformácii na β-listy a vlákna podobné amyloidu. keď sa tvoria gély.Okrem toho fúzne proteíny NT a zelený fluorescenčný proteín (GFP) alebo purínová nukleozid fosforyláza (PNP) tvoria hydrogély s plne funkčnými fúznymi fragmentmi.Vysokovýkonná expresia v heterológnych hostiteľoch spojená s rýchlou tvorbou hydrogélov za fyziologických podmienok otvára možnosť nákladovo efektívnej výroby hydrogélov s upravenými funkciami.
Na rozdiel od väčšiny uvádzaných rekombinantných spidroínových proteínov36 je His-NT2RepCT stabilný v pufri Tris-HCl pri pH 8 a môže sa koncentrovať až na 500 mg/ml bez zrážania25.Preto nás prekvapilo zistenie, že tento proteín pri inkubácii pri 37 °C rýchlo tvorí opticky číre, samonosné hydrogély (obr. 1b-d).Ďalšie štúdie ukázali, že gélovatenie His-NT2RepCT sa vyskytlo v širokom rozsahu koncentrácií proteínov (10–300 mg / ml) a že táto koncentrácia nepriamo korelovala s časom gélovatenia (obr. 1c a doplnkový obrázok 1).Aby sme zistili, ktoré časti His-NT2RepCT sprostredkovávajú tvorbu hydrogélu, potom sme skúmali každú doménu jednotlivo a v rôznych kombináciách pomocou testu inverzie banky (obrázok 1a, b).Všetky testované frakcie rekombinantného spidroínu vytvorili gély (pri koncentrácii proteínu 300 mg/ml) za menej ako 1 hodinu, s výnimkou precipitovaného 2Rep (obr. 1b).To naznačuje, že NT a CT samotné, v kombinácii alebo spojené s opakovaniami, môžu gélovať pri 37 ° C a že značka His6 neovplyvňuje tento proces vo významnej miere.Vzhľadom na všeobecnú predstavu, že NT je vysoko rozpustný a stabilný proteín a že predchádzajúce správy o rekombinantných spidroínových hydrogéloch pripisovali gélovacie účinky konformačným zmenám v opakujúcich sa oblastiach a / alebo CT, samotný NT by mohol.Objav gélu bol neočakávaný.Doplnková tabuľka 1) 37, 38, 39. Je pozoruhodné, že NT už géloval do 10 minút pri koncentrácii ≥ 300 mg/ml (obr. 1c).Experimenty s inverziou liekovky s rôznymi koncentráciami NT ukázali, že pri >50 mg/ml roztok NT géloval rýchlejšie ako His-NT2RepCT pri zodpovedajúcej koncentrácii (w/v, obrázok 1c).
Schematické znázornenie rôznych spidroínových konštruktov študovaných v tejto práci.b Čas gélovatenia pri 37 °C pre rôzne rekombinantné spidroínové proteíny (300 mg/ml) overený prevrátením liekovky.CT gél okamžite bez inkubácie (<300 mg/ml), 2Rep precipitáty (300 mg/ml, mierka 5 mm).c Čas gélovatenia His-NT2RepCT a NT pri uvedených koncentráciách proteínu pri 37 °C.d Fotografie hydrogélov His-NT2RepCT a NT s pavúkom a písmenom „NT“ vytlačeným pod nimi (obe 200 mg/ml, mierka 5 mm).
Hydrogély tvorené rôznymi rekombinantnými spidroínovými proteínmi majú mierne odlišné farby a pozorovanie voľným okom ukazuje rôzne stupne priehľadnosti (obr. 1b).NT gély sú výnimočne číre, zatiaľ čo iné gély sa stávajú nepriehľadnými.Gély His-NT2RepCT a NT odliate do valcových rúrok bolo možné vybrať z formy neporušené (obr. 1d).
Aby sa otestovalo, či povlaky prírodného pavúčieho hodvábu gélujú za podmienok, o ktorých sa teraz zistilo, že spôsobujú gélovatenie rekombinantných proteínov spidroínu, povlaky sa odobrali z veľkej ampulky pavúka švédskeho mostíka (Larinioides sclopetarius).Povlaky sa skladovali v 20 mM Tris-HCl tlmivom roztoku pri 50 mg/ml (na základe nameranej suchej hmotnosti), ale počas 21-dňovej inkubácie pri 37 °C sa nepozorovala žiadna želatinácia (doplnkový obrázok 2a).
Na kvantifikáciu týchto gélov možno použiť reologické merania na štúdium procesu gélovatenia a určenie celkových mechanických vlastností.Najmä monitorovanie skladovacieho modulu (elasticity) pri zvýšených teplotách môže poskytnúť informácie o teplote gélovatenia, ako aj o viskoelastických vlastnostiach povlaku.Experimenty s nárastom teploty (s použitím 1 °C/min pri 25-45 °C, na základe predchádzajúcich štúdií s použitím zásobných roztokov prírodného hodvábu)40,41 ukázali, že skladovacie moduly roztokov His-NT2RepCT a NT sa zvyšovali so zvyšujúcou sa teplotou.bol zvýšený (obr. 2 a doplnkový obr. 3).Je pozoruhodné, že modul NT začal rásť pri nižšej teplote v porovnaní s His-NT2RepCT, čo je v súlade s rýchlejším gélovým časom pozorovaným, keď bol NT priamo inkubovaný s His-NT2RepCT pri 37 ° C (obrázok 1).Po následnom poklese teploty sa akumulačný modul nevrátil k nižším hodnotám a zostal nad stratovým modulom (pozri doplnkový obrázok 3), čo naznačuje tepelne nevratnú stabilnú želatináciu.Po gélovatení sa konečný modul pružnosti pohyboval od 15 do 330 kPa pre hydrogély His-NT2RepCT pri koncentrácii 100–500 mg/ml a konečný modul pružnosti pre hydrogély NT (100–500 mg/ml) sa pohyboval od 2 do 1400 kPa (obr. , 2 a kompletné údaje rampy) pozri doplnkový obr. 3).
a Zmena teploty počas meraní His-NT2RepCT (300 mg/ml) a b NT (300 mg/ml) s trepaním.Šípky označujú trend teplôt a svetlejšie tieňovanie údajov pamäťového modulu znázorňuje testovanie pri nižších hodnotách krútiaceho momentu pre prístroj, ako uvádza výrobca, čo je príčinou zvýšenej hlučnosti.c Akumulácia His-NT2RepCT a NT na konci modulu po zvýšenej teplote (100, 300 a 500 mg/ml).Všetky údaje modulu sa odoberajú pri frekvencii 0,1 Hz.
Ako potenciálnu metódu na skúmanie konformačných zmien spojených s gélovatením sme zaznamenali FTIR spektrá His-NT2RepCT a NT pred a po gélovatení pri 37 ° C (obrázok 3a, b).Ako sa očakávalo, spektrá roztokov His-NT2RepCT a NT zodpovedali proteínom vykazujúcim sekundárnu štruktúru a-helix/náhodná cievka s výrazným pásom pri 1645 cm-1.Pre oba hydrogély gélovanie viedlo k vytvoreniu dvoch ramien v strednom I páse pri asi 1617 cm-1 a 1695 cm-1 (obr. 3a, b), čo naznačuje tvorbu antiparalelných β-listových štruktúr.Tieto zmeny možno tiež jasne vidieť v príslušnom druhom derivačnom a rozdielovom gélovacom spektre (doplnkový obrázok 4b).Dva pásy NT p-vrstvy boli výraznejšie ako pásy His-NT2RepCT, čo naznačuje, že celkový obsah pásov p-vrstvy v NT hydrogéli bol vyšší ako v hydrogéle NT2RepCT.
FTIR absorpčné spektrá His-NT2RepCT a bNT (obe 500 mg/ml) pred (roztok) a po (gél) inkubáciou pri 37 °C.c TEM snímky resuspendovaných 50 mg/ml NT2RepCT gélov a d NT.Mierka 200 nm.e Priemery vlákien His-NT2RepCT a NT hydrogélov.n = 100 nameraných fibríl, p < 0,0001.Chybové úsečky zobrazujú štandardnú odchýlku.Stred chybových pruhov je priemer.Na štatistickú analýzu sa použil nepárový t-test (obojstranný).f ThT fluorescencia rôznych rekombinantných proteínov spidroínu (100 mg/ml) pri 37 °C bez trepania.g NT (100 mg/ml) inokulačné experimenty zo 100 mg/ml NT gélu s 0 %, 5 %, 10 % a 20 % semenami.
Analýza gélu pomocou transmisnej elektrónovej mikroskopie (TEM) ukázala, že hydrogél pozostáva z fibríl podobných amyloidu (obr. 3c, 3d).NT-formované fibrily boli predĺžené (5-12 nm v priemere) a nerozvetvené, zatiaľ čo His-NT2RepCT fibrily mali kratšiu dĺžku a výrazne širší priemer (7-16 nm) (obr. 3e).Tieto výsledky nám umožnili sledovať kinetiku fibrózy pomocou testu tioflavínu T (ThT).Pre všetky rekombinantné spidroínové proteíny sa fluorescenčný signál zvýšil, keď sa vzorky inkubovali pri 37 ° C (obr. 3f, doplnkový obrázok 5a).V súlade s týmto zistením mikroskopické vyšetrenie NT a His-NT2RepCT v podmienkach gélovania odhalilo rovnomerné zvýšenie fluorescencie ThT bez výraznej lokálnej akumulácie ThT-pozitívnych agregátov (doplnkový obrázok 5b, c).Tvorba ThT-pozitívnych fibríl nebola sprevádzaná zvýšením zákalu NT a His-NTCT (doplnkový obrázok 5d), čo znamená, že v géli sa mohla vytvoriť sieť fibríl bez zníženia čírosti gélu.Naočkovanie pridaním malých množstiev vopred vytvorených fibríl môže výrazne urýchliť tvorbu fibríl niektorých amyloidov42, 43, 44, ale pridanie 5 %, 10 % alebo 20 % (w/w) NT do roztoku NT hydrokoagulantov.výsevný efekt (obr. 3g).Možno je to spôsobené tým, že fibrily v hydrogéle sú relatívne fixované a nemožno ich použiť ako semená.
Neočakávané správanie rekombinantných spidroínových proteínov pri vysokých teplotách podnietilo ďalšie štúdie nukleárnej magnetickej rezonancie (NMR) na identifikáciu konformačných zmien spojených s tvorbou gélu.NMR spektrá roztokov His-NT2RepCT zaznamenané v priebehu času pri 37 °C ukázali, že CT bol stále čiastočne zložený, zatiaľ čo signály NT a 2Rep zmizli (obr. 4a), čo naznačuje, že to boli hlavne NT a 2Rep, ktoré čiastočne kontrolovali tvorbu His- NT2RepCT hydrogél.Signál CT bol tiež zoslabený na 20 % svojej pôvodnej intenzity, čo naznačuje, že CT je tiež väčšinou fixované a začlenené do hydrogélovej štruktúry.Pre menšiu časť CT, ktorá je taká mobilná ako v predinkubovanej vzorke a teda pozorovaná pomocou NMR v roztoku, spektrá postrádajú signály pre prvých 10 štruktúrovaných zvyškov, pravdepodobne v dôsledku ťažkej imobilizácie pripojenej časti His-NT2Rep.NMR spektrá -stavu hydrogélov -NT2RepCT odhalili prevládajúcu prítomnosť α-helixov a β-vrstiev a v menšej miere aj konformáciu náhodných cievok (obr. 4b).Analýza chemického posunu metionínových zvyškov prítomných iba v NT ukázala, že táto doména bola konvertovaná na štruktúru β-listu.Časovo závislé spektrá NT v roztoku ukázali rovnomerný pokles intenzity signálu (obr. 4c) a NMR NT hydrogélov v tuhom stave ukázala, že väčšina zvyškov NT bola prevedená na štruktúry β-listu (obr. 4d).Konformáciu 2Rep nebolo možné určiť oddelene kvôli jeho tendencii agregovať.NMR spektrá v pevnom stave hydrogélov NTCT a His-NT2RepCT však vyzerali veľmi podobne (obr. 4b; doplnkový obrázok 6b), čo naznačuje, že 2Rep prispel málo k štruktúrnej časti hydrogélu His-NT2RepCT.Pre CT hydrogély sa zistilo, že existujú a-helixy, β-listy a náhodné špirálové sekundárne štruktúry (doplnkový obrázok 6d).To naznačuje, že niektoré časti CT zostávajú α-helixy, zatiaľ čo iné sa stávajú β-listami.Výsledky NMR spektroskopie teda naznačujú, že NT je dôležitý pre tvorbu hydrogélu a tiež sa transformuje na konformáciu β-listu po fúzii s 2Rep a CT.V súlade s tým sme nedávno zistili, že amyloidné priestorové zipsy sa pravdepodobne tvoria vo všetkých piatich helixoch NT domény a Waltzov algoritmus predpovedal amyloidogénnu oblasť v helixe 1 (obr. 4e).
2D spektrá 15N-HSQC 10 mg/ml roztoku His-NT2RepCT pred (modrá) a 19 hodín po inkubácii (červená) pri 37 °C.Jednotlivé krížové píky v červenom spektre a F24, G136, polyA v modrom spektre sú označené jednopísmenovými symbolmi aminokyselín a číslami zvyškov.Vložky ukazujú závislosť intenzity signálu od času pre vybrané zvyšky z domén NT, 2Rep a CT.b Rádiofrekvenčné spektrá v tuhom stave (RFDR) hydrogélov His-NT2RepCT.Korelácie zvyškov Ca/Cp pozorované v spektrách RFDR boli stanovené porovnaním s modelovými chemickými posunmi peptidov a hodnotami odvodenými zo štatistík82, 83 a ich sekundárnych štruktúr.SSB – otočný postranný pás.c Jednorozmerné spektrá roztoku 15N-HSQC 10 mg/ml NT počas inkubácie pri 37 °C počas 36 hodín.Vložka ukazuje objemovú intenzitu v závislosti od času.d RFDR spektrá NT hydrogélov v tuhom stave.Sú uvedené korelácie zvyškov Ca/Cp a ich sekundárnych štruktúr pozorovaných v spektrách RFDR.e Na základe profilu náchylnosti k fibrilácii NT45.79 z databázy Zipper (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/).Energia Rosetta priestorového okna posunu blesku hexapeptidu je uvedená v kcal/mol.Červené stĺpce označujú hexapeptidy s vysokým sklonom k ​​fibróze (energia Rosetta pod -23 kcal/mol; pod bodkovanou čiarou).Zelené pruhy označujú fragmenty s energiami Rosetta nad prahom, a preto je menej pravdepodobné, že sa vytvoria stérické zipsy.Fragmenty obsahujúce prolín boli z analýzy vylúčené (bez stĺpcov).Štvorce označujú oblasti amyloidózy predpovedané algoritmom Waltz81 (https://waltz.switchlab.org).Sekvencia aminokyselinových zvyškov NT je navrchu a typy zvyškov nachádzajúce sa v β sekundárnej štruktúre (určené NMR spektroskopiou v tuhom stave) sú znázornené červenou farbou.Polohy piatich NT a-helixov sú označené ako (H1-H5)28.
Pri pH < 6,5 HT dimerizuje a je odolný voči denaturácii vyvolanej teplom alebo močovinou18.Aby sa objasnilo, ako dimerizácia a stabilita NT ovplyvňujú gélovatenie, roztoky obsahujúce 100 mg/ml NT sa kontrolovali pri pH 8, 7 a 6 pomocou testu prevrátenia liekovky.Vzorky NT inkubované pri pH 8 a 7 gélovali po 30 minútach pri 37 °C, ale gél s pH 8 zostal číry, zatiaľ čo gél s pH 7 vykazoval viditeľnú zrazeninu (obr. 5a).Na rozdiel od toho roztok obsahujúci HT pri pH 6 netvoril gél a veľká zrazenina bola viditeľná po 20 minútach pri 37 °C.To naznačuje, že samotné diméry a/alebo ich vyššia stabilita v porovnaní s monomérmi zabraňujú gélovateniu.Tvorba zrazeniny pre NT pri pH 7 a 6 sa neočakávala, pretože sa uvádza, že NT je rozpustný pri 200 mg/ml27, po tepelnej denaturácii sa ľahko znovu zloží a tiež si zachováva a-helix pri nižších hodnotách pH 18. Pravdepodobným vysvetlením týchto nezrovnalostí je, že predtým uvádzané experimenty sa uskutočnili pri teplote miestnosti alebo nižšej alebo pri relatívne nízkych koncentráciách proteínov16,18,19.
NT test na prevrátenie fľaštičky (100 mg/ml) pri pH 8, 7, 6 a 154 mM NaCl (pH 8) po inkubácii pri 37 °C.b NT CD spektrá s a bez 154 mM NaF a 154 mM NaCl, v danom poradí.Molárna elipticita pri 222 nm sa prevedie na podiel prirodzených záhybov.c Test inverzie NT (100 mg/ml) NT* (37 °C a 60 °C), NTA72R (37 °C) a His-NT-L6 (37 °C a 60 °C).d CD spektrá NT mutantov NT*, NTA72R a His-NT-L6.Molárna elipticita pri 222 nm sa prevedie na podiel prirodzených záhybov.e Inverzný test NTFlSp, NTMiSp a zníženého NTMiSp (100 mg/ml).Mierka 5 mm.f CD spektrá NT, NTFlSp, NTMiSp a redukované NTMiSp.Molárna elipticita pri 222 nm sa prevedie na podiel prirodzených záhybov.Úplné NT spektrá pri 25 ° C a 95 ° C sú znázornené na doplnkovom obrázku 8.
Fyziologická koncentrácia soli určuje elektrostatické interakcie medzi podjednotkami NT a dimerizáciu prenosu NT na nižšie pH18.Zistili sme, že prítomnosť 154 mM NaCl a NaF skutočne inhibovala gélovatenie (obr. 5a, b; doplnkový obrázok 2b) a že tieto soli zvýšili tepelnú stabilitu NT monomérov (obr. 5b, doplnkový obrázok 8). .To tiež naznačuje, že zvýšenie stability, skôr než dimerizácia, zabraňuje tvorbe gélu.
Na ďalšie preskúmanie úlohy dimerizácie proteínov a stability pri gélovatení sme použili dva mutanty, NT* a NTA72R, ktoré tiež zostávajú monomérne pri nízkom pH 28,30.NT* je mutant s dvojitým reverzným nábojom, v ktorom je zdanlivá dipolárna distribúcia náboja monoméru sploštená, čo zabraňuje dimerizácii a drasticky zvyšuje stabilitu monoméru.NTA72R je nabitý dipól, ale Ala substituovaná Arg sa nachádza na hranici diméru, takže mutácie interferujú s interakciami podjednotiek potrebnými na dimerizáciu.Po inkubácii pri 37 °C NT* nevytvoril hydrogél, zatiaľ čo NTA72R vytvoril nepriehľadný gél počas 15 minút (obr. 5c).Pretože NT* aj NTA72R nemôžu dimerizovať, ale líšia sa stabilitou monoméru (obr. 5d), tieto výsledky silne naznačujú, že vysoká termodynamická stabilita zabraňuje gélovateniu NT.Podporuje to aj skutočnosť, že HT* tvorí gél, keď je nestabilný pri vysokej teplote (po 8 minútach pri 60 °C; obr. 5c).Už skôr sa ukázalo, že vysoký obsah metionínu v NT skvapalňuje jeho prirodzené skladanie a že šesť náhrad Met až Leu (tu označovaných ako His-NT-L6) silne stabilizuje monomér NT46.Na základe predpokladu, že na tvorbu NT gélu je potrebná štrukturálna flexibilita, sme zistili, že stabilný mutant His-NT-L6 negéloval pri 37 ° C (obrázok 5c, d).His-NT-L6 však tiež vytvoril gél po inkubácii pri 60 °C počas 60 minút (obr. 5c).
Zdá sa, že schopnosť NT transformovať sa na štruktúry β-listu a vytvárať hydrogély sa vzťahuje na niektoré, ale nie všetky NT domény spidroínu.NT z rôznych typov hodvábu a druhov pavúkov, Trichonephila clavipes (NTFlSp), vytvorili gély napriek ich relatívne nízkemu obsahu metionínu a vysokej tepelnej stabilite (obr. 5e, f a doplnková tabuľka 2).Na rozdiel od toho NT z malého ampulárneho proteínového spidroínu z Araneus ventricosus (NTMiSp) s nízkou tepelnou stabilitou a vysokým obsahom metionínu netvoril hydrogély (doplnková tabuľka 2 a obr. 5e, f).Ten môže byť spojený s prítomnosťou intramolekulárnych disulfidových väzieb29,47.V súlade s tým, keď boli disulfidové väzby NTMiSp redukované, vytvoril hydrogél po inkubácii pri 37 ° C počas 10 minút (obr. 5e).Na záver je potrebné poznamenať, že štrukturálna flexibilita je dôležitým, ale nie jediným kritériom pre tvorbu gélu z NT.Ďalším faktorom, ktorý môže byť relevantný, je sklon k tvorbe amyloidných fibríl a analýza pomocou databázy zipsov a algoritmu Waltz ukázala koreláciu medzi schopnosťou vytvárať gély a prítomnosťou amyloidogénnych oblastí, ako aj rozsahom predpokladaných oblastí. na vytvorenie stérických zipsov.Existovala korelácia (doplnková tabuľka 2 a doplnkový obrázok 9).
Schopnosť NT vytvárať fibrily a vytvárať gély za priaznivých podmienok nás viedla k hypotéze, že fúzie NT s inými proteínovými fragmentmi môžu stále vytvárať gély s plnou funkciou fúznych partnerov.Aby sme to otestovali, zaviedli sme zelený fluorescenčný proteín (GFP) a purínovú nukleozidfosforylázu (PNP) na C-koniec NT.Výsledné fúzne proteíny boli exprimované v E. coli s veľmi vysokými konečnými výťažkami (150 mg/l a 256 mg/l kultúry v trepacích fľašiach pre His-NT-GFP a His-NT-PNP, v tomto poradí), čo je v súlade s tým, čo sa ukázalo pre iné proteíny fúzované s NT Ref.30. His-NT-GFP (300 mg/ml) a His-NT-PNP (100 mg/ml) fúzne proteíny vytvorili gély po 2 hodinách a 6,5 ​​hodinách pri 37 °C a čo je dôležité, frakcia GFP zostala nezmenená.pozorované po gélovatení, pričom >70 % počiatočnej intenzity fluorescencie zostalo po gélovatení (obr. 6a).Na meranie aktivity PNP v roztokoch a géloch his-NT-PNP sme museli zriediť fúzny proteín s NT, pretože enzymatická aktivita čistého prípravku bola mimo detekčného rozsahu testu pri gélujúcich koncentráciách.Gél vytvorený so zmesou obsahujúcou 0,01 mg/ml His-NT-PNP a 100 mg/ml NT si zachoval 65 % počiatočnej enzymatickej aktivity predinkubovaných vzoriek (obr. 6b).Gél zostal počas merania neporušený (doplnkový obrázok 10).
a Relatívna intenzita fluorescencie pred a po gélovatení His-NT-GFP (300 mg/ml) a obrátená liekovka obsahujúca hydrogél His-NT-GFP (300 mg/ml) pod viditeľným a UV svetlom.Body ukazujú jednotlivé merania (n = 3), chybové úsečky ukazujú smerodajnú odchýlku.Priemerná hodnota je zobrazená v strede chybových pruhov.b Aktivita PNP sa získala fluorometrickou analýzou s použitím roztokov a gélov pozostávajúcich z NT (100 mg/ml) a zmesi obsahujúcej 0,01 mg/ml his-NT-PNP a 100 mg/ml nových taiwanských dolárov.Vložka ukazuje prevrátenú fľaštičku obsahujúcu hydrogél obsahujúci His-NT-PNP (5 mm mierka).
Tu uvádzame tvorbu hydrogélov z NT a iných rekombinantných spidroínových proteínov inkubáciou proteínového roztoku pri 37 ° C (obrázok 1).Ukazujeme, že gélovatenie je spojené s premenou α-helixov na β-vrstvy a tvorbou fibríl podobných amyloidom (obr. 3 a 4).Toto zistenie je prekvapujúce, pretože NT sú stočené globulárne päťzávitnicové zväzky známe svojou extrémne vysokou rozpustnosťou a vysokou stabilitou pri koncentráciách > 200 mg/ml pri 4 °C počas niekoľkých dní27.Okrem toho sa NT ľahko preskladajú po tepelnej denaturácii pri nízkych koncentráciách proteínu v uM.Podľa našich výsledkov si tvorba fibríl vyžaduje kombináciu koncentrácie proteínu >10 mg/ml a mierne zvýšenej teploty (obr. 1).To je v súlade s myšlienkou, že amyloidné fibrily sa môžu tvoriť z globulárne poskladaných proteínov, ktoré sú v čiastočne rozvinutom stave v dôsledku tepelných fluktuácií za fyziologických podmienok48.Príklady proteínov, ktoré podliehajú tejto premene, zahŕňajú inzulín49,50, β2-mikroglobulín, transtyretín a lyzozým51,52,53.Hoci NT je vo svojom natívnom stave a-helix, približne 65 % polypeptidového reťazca je kompatibilných s tvorbou stérického zipsu (obr. 4e)45.Keďže monomér je dynamicky mobilný46, môže vystaviť tieto potenciálne amyloidogénne oblasti pri mierne zvýšených teplotách a pri vysokých koncentráciách celkového proteínu môže dosiahnuť kritickú koncentráciu pre tvorbu amyloidných vlákien54.Na základe tejto úvahy sme zistili negatívnu koreláciu medzi koncentráciou spidroínu a dobou gélovatenia (obr. 1c), a ak je monomérna NT konformácia stabilizovaná buď mutáciami (NT*, His-NT-L6) alebo pridaním soli, môže zabrániť tvorba hydrogélov (obr. 5).
Vo väčšine prípadov amyloidné fibrily zmiznú z roztoku ako zrazenina, ale za určitých podmienok môžu vytvárať hydrogély55,56,57.Fibrily tvoriace hydrogél majú zvyčajne vysoký pomer strán a tvoria stabilné trojrozmerné siete prostredníctvom molekulárneho zapletenia, 55, 58 v súlade s našimi výsledkami.Na tvorbu hydrogélu in vitro sa proteíny často úplne alebo čiastočne rozvinú, napríklad vystavením organickým rozpúšťadlám, vysokej teplote (70–90 °C) a/alebo nízkemu pH (1,5–3,0)59,60,61,62.Tu opísané spidroínové hydrogély nevyžadujú drsné spracovanie, ani nevyžadujú sieťovacie činidlá na stabilizáciu hydrogélov.
Už skôr bolo hlásené, že spidroínové opakovania a QD, ktoré podľa všetkého podliehajú prepínaniu β-listov počas pradenia hodvábu, tvoria hydrogély.V porovnaní s našimi zisteniami boli inkubačné časy a/alebo inkubačné teploty výrazne dlhšie alebo vyššie a výsledné hydrogély boli často nepriehľadné (obrázok 7 a doplnková tabuľka 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. Okrem rýchlych gélovacích časov NT hydrogély >300 mg/ml (30 %) prekonali všetky ostatné opísané rekombinantné hydrogély z pavúčieho hodvábu, ako aj prírodné hydrogély, ako je želatína, alginát (2 %), agar (0,5 % ) a kolagénom.(0,6 %) (obrázok 7 a doplnkové tabuľky 1 a 3)37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
Čas gélovatenia a modul pružnosti hydrogélov v tejto štúdii sa porovnávali s inými hydrogélmi na báze spidroínu a vybranými prírodnými hydrogélmi.Referencie sú uvedené spolu s opisom podmienok gélovatenia.APS persíran amónny, izbová teplota.Údaje 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
Zdá sa, že pavúky vyvinuli spôsoby, ako zabrániť želatínovaniu spidroínu počas skladovania.Napriek vysokej koncentrácii proteínu v hodvábnej žľaze, veľká opakujúca sa oblasť spojená s terminálnou doménou znamená, že zjavná koncentrácia NT a CT v žľaze zodpovedá približne 10-20 mg/ml, na hranici tejto štúdie.potrebné na in vitro pozorovanú tvorbu hydrogélu.Okrem toho podobné koncentrácie solí 16 stabilizovali NT ako v hodvábnych žľazách (obr. 5b).Konformácia NT bola študovaná v cytosóle E. coli a zistilo sa, že je tesnejšie poskladaná ako pri skúmaní in vitro, čo ďalej naznačuje, že soľ alebo iné faktory bránia jej agregácii in vivo.Schopnosť NT transformovať sa na fibrily p-listu však môže byť dôležitá pre tvorbu filamentov a mala by sa preskúmať v budúcich štúdiách.
Okrem nových aspektov tvorby fibríl a hydrogélu podobných NT-amyloidom pozorovaným v tejto štúdii sme tiež ukázali, že tento jav môže mať biotechnologické a biomedicínske aplikácie (obr. 8).Ako dôkaz koncepcie sme kombinovali NT s GFP alebo PNP a ukázali sme, že fúzny proteín tiež tvorí hydrogély pri inkubácii pri 37 ° C a že frakcie GFP a PNP si do značnej miery zachovávajú svoju aktivitu po gélovatení (obrázok 6).Nukleozidové fosforylázy sú dôležitými katalyzátormi syntézy nukleozidových analógov75, vďaka čomu je náš objav relevantný pre biofarmaceutický priemysel.Koncept expresie fúznych proteínov, ktoré tvoria transparentné hydrogély za priaznivých podmienok, umožňuje vytvorenie funkcionalizovaných hydrogélov s priaznivými vlastnosťami pre širokú škálu aplikácií, ako je imobilizácia enzýmov, riadené uvoľňovanie liečiv a tkanivové inžinierstvo.Okrem toho sú NT a NT* účinné expresné markery30, čo znamená, že NT a jeho varianty možno použiť na vysokovýkonnú produkciu rozpustných fúznych proteínov a následnú tvorbu imobilizovaných cieľových proteínov v 3D hydrogéloch.
NT je rozpustný, a-helikálny a stabilný pri nízkych koncentráciách (uM) a 37 °C.Pri rovnakej teplote, ale pri zvyšujúcich sa koncentráciách (>10 mg/ml), NT tvorí gély pozostávajúce z fibríl podobných amyloidu.NT fúzne proteíny tiež tvoria fibrilárne gély s plne funkčnými fúznymi fragmentmi, čo umožňuje imobilizáciu rôznych proteínov v 3D hydrogéloch pomocou NT.Dole: NT (PDB: 4FBS) a ilustrácie vláknových sietí a pridružených proteínových štruktúr (predpokladá sa a nie sú nakreslené v mierke, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2210/pdb4RJ2/pdb).
Konštrukty (pozri doplnkovú tabuľku 4 pre úplný zoznam vrátane aminokyselinových sekvencií) boli klonované do plazmidu pT7 a transformované do E. coli BL21 (DE3).Upravené plazmidy obsahujúce E. coli sa naočkovali v bujóne Luria doplnenom kanamycínom (70 mg/l) a pestovali sa cez noc pri 30 °C a 250 ot./min.Kultúra sa potom inokulovala v pomere 1/100 do LB média obsahujúceho kanamycín a kultivovala sa pri 30 °C a 110 ot./min, kým OD600 nedosiahla 0,8.Pre NMR štúdie sa baktérie pestovali v minimálnom médiu M9 obsahujúcom 2 g D-glukózy 13C (Aldrich) a 1 g chloridu amónneho 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) na značenie proteínov izotopmi.Znížte teplotu na 20 stupňov Celzia a indukujte expresiu proteínu pomocou 0,15 mM izopropyltiogalaktopyranozidu (konečná koncentrácia).Po expresii proteínu cez noc sa bunky zozbierali pri 7278 x g, 4 ° C počas 20 minút.Bunkové pelety sa resuspendovali v 20 mM Tris-HCI, pH 8 a zmrazili sa až do ďalšieho použitia.Rozmrazené bunky boli lyzované pomocou bunkového disruptora (zariadenia série TS, Constant Systems Limited, Anglicko) pri 30 kPa.Potom sa lyzáty centrifugovali pri 25 000 g počas 30 minút pri 4 °C.Pre NTMiSp sa peleta potom resuspendovala v 2 M močovine, 20 mM Tris-HCl, pH 8, a sonikovala sa 2 minúty (2 s zapnuté/vypnuté, 65 %), potom sa znova odstredila pri 25 000 xg, 4 °C v rámci 30 min.Supernatant bol nanesený na kolónu Ni-NTA, premytý 20 mM Tris-HCl, 2 mM imidazol, pH 8 a nakoniec bol proteín eluovaný 20 mM Tris-HCl, 200 mM imidazolom, pH 8. Vytvorenie NT2RepCT a NTCT, štiepenie trombínom zavedie miesto (ThrCleav) medzi His a NT.Miesta štiepenia trombínu sú tiež prítomné v His-NT-ThrCleav-2Rep (produkuje 2Rep), His-thioredoxin-ThrCleav-NT (produkuje NT), His-thioredoxin-ThrCleav-CT (produkuje CT), His-Thioredoxin-ThrCleav-NT .* (produkuje NT*), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (produkuje NTA72R), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (produkuje NTF1Sp) a His-Sulphur Redoxin-ThrCleav-NTMiSp (produkuje NTMiSp).Konštrukty sa štiepili trombínom (1:1000) a dialyzovali sa cez noc pri 4 °C s 20 mM Tris-HCl, pH 8, s použitím dialyzačnej membrány Spectra/Por s prahom molekulovej hmotnosti 6-8 kDa.Po dialýze sa roztok nanesie na Ni-NTA kolónu a efluent obsahujúci proteín, ktorý je predmetom záujmu, sa odoberie.Koncentrácie proteínov boli stanovené meraním UV absorbancie pri 280 nm s použitím extinkčného koeficientu každého proteínu, okrem NTF1Sp, ktorý použil Bradfordov test podľa protokolu výrobcu.Čistota bola stanovená elektroforézou na SDS polyakrylamidovom (4–20 %) géli a farbením Coomassie brilantnou modrou.Proteíny sa koncentrovali pomocou centrifugačných filtrov (VivaSpin 20, GE Healthcare) pri 4000 xg s medzou molekulovou hmotnosťou 10 kDa v 20-minútových cykloch.
Rozmrazte proteínový roztok a opatrne napipetujte 150 µl do 1 ml priehľadnej septum liekovky (8 x 40 mm Thermo Scientific).Skúmavky boli uzavreté a utesnené parafilmom, aby sa zabránilo vyparovaniu.Vzorky (n = 3) sa inkubovali pri 37 °C alebo 60 °C a periodicky sa prevracali, aby sa pozorovala želatinácia.Vzorky, ktoré negélovali, sa inkubovali aspoň jeden týždeň.Znížte NTMiSp disulfidové väzby pomocou 10 mM DTT na 10 uM proteínu.Na analýzu gélovatenia povlakov z prírodného pavúčieho hodvábu sa odrezal švédsky mostík, dve hlavné ampulované žľazy sa umiestnili do 200 ul 20 mM Tris-HCl tlmivého roztoku pH 8 a narezali sa, aby sa umožnilo povlaku oddeliť sa od žliaz..Obsah žliaz sa rozpustí v pufri, 50 ul na stanovenie suchej hmotnosti (inkubáciou otvorených fľaštičiek pri 60 °C do konštantnej hmotnosti) a 150 ul na gélovatenie pri 37 °C.
Meracia geometria/nástroj je vyrobený z nehrdzavejúcej ocele pomocou paralelnej dosky s horným priemerom 20 mm a medzerou 0,5 mm.Vzorku zahrejte z 25 °C na 45 °C a späť na 25 °C rýchlosťou 1 °C za minútu pomocou Peltierovej platne s dnom z nehrdzavejúcej ocele.Merania vibrácií sa uskutočňovali pri frekvencii 0,1 Hz a v lineárnej viskoelastickej oblasti materiálu pri napätí 5 % a 0,5 % pre vzorky 100 mg/ml a 300–500 mg/ml.Aby ste zabránili vyparovaniu, použite vlastnú vlhkú komoru.Dáta sa analyzovali pomocou Prism 9.
Na zber infračervených (IR) spektier pri izbovej teplote od 800 do 3900 cm-1.ATR zariadenie, ako aj svetelná dráha cez spektrometer, sa pred a počas experimentu prepláchnu suchým filtrovaným vzduchom.Na kryštály sa pipetovali roztoky (500 mg/ml, aby sa minimalizovali piky absorpcie vody v spektrách) a pred meraním sa vytvorili gély (500 mg/ml), ktoré sa potom preniesli na kryštály (n = 3).Zaznamenalo sa 1000 skenov s rozlíšením 2 cm-1 a nulovým pracovným cyklom 2. Druhá derivácia bola vypočítaná pomocou OPUS (Bruker) s použitím rozsahu vyhladzovania deviatich bodov.Spektrá boli normalizované na rovnakú integračnú oblasť medzi 1720 a 1580 cm-1 pomocou F. Menges „Spectragryph – Optical Spectroscopy Software“.V ATR-IR spektroskopii je hĺbka prieniku infračerveného lúča do vzorky závislá na vlnovom čísle, čo vedie k silnejšej absorpcii pri nižších vlnových číslach ako pri vyšších vlnových číslach.Tieto účinky neboli korigované pre spektrá znázornené na obr.3, pretože sú veľmi malé (doplnkový obr. 4).Opravené spektrá pre tento obrázok sa vypočítali pomocou softvéru Bruker OPUS.
V zásade je možná komplexná kvantifikácia proteínových konformácií po spoľahlivej dekonvolúcii zložiek v rámci vrcholu amidu I.V praxi však vznikajú určité prekážky.Šum v spektre sa môže objaviť ako (falošné) vrcholy počas dekonvolúcie.Okrem toho pík v dôsledku ohýbania vody sa zhoduje s polohou píku amidu I a môže mať podobnú veľkosť pre vzorky obsahujúce veľké množstvo vody, ako je tu študovaný vodný gél.Preto sme sa nepokúšali úplne rozložiť vrchol amidu I a naše pozorovania by sa mali zvážiť iba na podporu iných metód, ako je NMR spektroskopia.
Roztoky 50 mg/ml NT a His-NT2RepCT sa gélovali cez noc pri 37 °C.Hydrogél sa potom zriedil s 20 mM Tris-HCl (pH 8) na koncentráciu 12,5 mg/ml, dobre sa pretrepal a odpipetoval, aby sa gél rozbil.Ďalej sa hydrogél 10-krát zriedil s 20 mM Tris-HCl (pH 8), 5 μl vzorky sa nanieslo na medenú mriežku potiahnutú formvarom a prebytočná vzorka sa odstránila pijavým papierom.Vzorky sa dvakrát premyli 5 ul vody MilliQ a farbili sa 1% uranylformiátom počas 5 minút.Prebytočnú škvrnu odstráňte savým papierom a potom sieťku vysušte na vzduchu.Zobrazovanie sa uskutočnilo na týchto mriežkach pomocou FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN pracujúceho pri 100 kV.Obrázky boli zaznamenané pri zväčšení x 26 500 a x 43 000 pomocou CCD kamery Veleta 2k x 2k (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, Nemecko).Pre každú vzorku (n = 1) sa zaznamenalo 10–15 obrázkov.ImageJ (https://imagej.nih.gov/) sa použil na analýzu obrazu a meranie priemerov vlákien (n = 100, rôzne vlákna).Prism 9 sa použil na uskutočnenie nepárových t-testov (obojstranných).Priemerné His-NT2RepCT a NT fibrily boli 11,43 (SD 2,035) a 7,67 (SD 1,389) nm.Interval spoľahlivosti (95 %) je -4,246 až -3,275.stupne voľnosti = 198, p < 0,0001.
80 ul kvapalných vzoriek obsahujúcich 10 uM tioflavín T (ThT) sa meralo trojmo (n = 3) za statických podmienok s použitím doštičiek Corning s 96-jamkovým čiernym dnom s čírym dnom (Corning Glass 3881, USA).Fluorescenčné rozdiely boli zaznamenané pomocou 440 nm excitačného filtra a 480 nm emisného filtra (FLUOSTar Galaxy od BMG Labtech, Offenburg, Nemecko).ThT signál nebol ani nasýtený, ani utlmený, pretože experimenty s rôznymi koncentráciami ThT boli uskutočňované bez zmeny intenzity signálu.Zaznamenajte absorbanciu pri 360 nm na meranie zákalu.Na pokusy s naočkovaním sa pri 37 °C vytvorili gély s koncentráciou 100 mg/ml, resuspendovali sa a použili na naočkovanie v molárnych pomeroch 5 %, 10 % a 20 %.Dáta sa analyzovali pomocou Prism 9.
Rozmrazte zásoby His-NT2RepCT a NT >100 mg/ml na ľade a prefiltrujte cez 0,22 um filter.Koncentrácie sa vypočítali meraním absorbancie pri 280 nm pomocou Nanodrop.V jamkách 96-jamkovej čiernej neväzbovej platne (Corning) s čírym dnom boli vzorky zriedené na 20 mg/ml v 20 mM Tris-HCl pH 8 a zmiešané s 5 μM ThT (konečná koncentrácia), celková koncentrácia vzorky objem 50 μl.Vzorky sa zobrazovali každých 10 minút pri 37 °C na mikroskope CellObserver (Zeiss) s kanálom prepusteného svetla a súpravami FITC excitačných a emisných filtrov pre ThT zobrazovanie.Na snímanie sa používa šošovka 20x/0,4.Na analýzu obrazu sa použili Zen Blue (Zeiss) a ImageJ (https://imagej.nih.gov/).Gély sa tiež pripravili z roztokov NT a His-NT2RepCT v koncentrácii 50 mg/ml obsahujúcich 20 mM Tris pH 8 a 5 uM ThT a inkubovali sa pri 37 °C počas 90 minút.Kúsky gélu sa preniesli do novej jamky obsahujúcej 20 mM Tris, pH 8 a 5 uM ThT v neväzbovej čiernej doštičke s 96 jamkami s čírym dnom.Získajte obrázky zelenej fluorescencie a jasného poľa pri zväčšení 20x/0,4.ImageJ sa použil na analýzu obrazu.
Spektrá roztokovej NMR sa získali pri 310 K na 600 MHz spektrometri Bruker Avance Neo vybavenom QCI Quadrupole Resonance Pulsed Gradient Field Cryoprobe (HFCN).NMR vzorky obsahujúce 10 mg/ml homogénneho proteínu značeného 13C, 15N, rozpusteného v 20 mM Tris-HCl (pH 8), 0,02 % (w/v) NaN3, 5 % DO (v/v), (n = 1) .Chemické posuny NT2RepCT pri pH 6,7 sa použili na určenie vrcholu 23 v 2D spektre 15N-HSQC.
Spektrá NMR pevnej látky s magickým uhlom rotácie (MAS) 13C, 15N-značených hydrogélov boli zaznamenané na spektrometri Bruker Avance III HD pri 800 MHz vybavenom 3,2 mm 13C/15N{1H} bezelektrónovou sondou.Teplota vzorky bola riadená pomocou prúdu plynu s premenlivou teplotou pri 277 K. Dvojrozmerné dipólové rotačné rezonančné (DARR)76 a rádiofrekvenčné znovuprepojovacie (RFDR)77 spektrá boli získané pri MAS frekvenciách 12,5 kHz a 20 kHz.Krížová polarizácia (CP) od 1H do 13C sa uskutočnila pomocou lineárnej rampy od 60,0 do 48,0 kHz pri 1H, 61,3/71,6 kHz pri 13C (pri 12,5/20 kHz MAS) a kontaktnom čase 0,5–1 ms.Počas zberu údajov sa použilo oddelenie Spinal6478 pri 73,5 kHz.Čas akvizície bol 10 milisekúnd a oneskorenie cyklu bolo 2,5 sekundy.Jednoväzbové korelácie Ca/Cp pozorované v spektrách RFDR boli priradené na základe charakteristických chemických posunov typu zvyškov a viacnásobne prepojených korelácií v spektrách DARR.
Databáza Zipper79 (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) sa použila na vyhodnotenie tendencií flutteru a energie Rosetta pre NT, NTFlSp a NTMiSp.Databáza Zipper počíta Rosetta Energy80, ktorá kombinuje niekoľko funkcií voľnej energie na modelovanie a analýzu proteínovej štruktúry.Energetická hladina -23 kcal/mol alebo nižšia indikuje vysoký sklon k fibrilácii.Nižšia energia znamená väčšiu stabilitu dvoch β-pramienkov v konformácii zipsu.Okrem toho bol algoritmus Waltz použitý na predpovedanie amyloidogénnych oblastí v NT, NTFlSp a NTMiSp Ref.81. (https://waltz.switchlab.org/).
Roztok NT proteínu sa zmiešal s tlmivým roztokom kyseliny 2-(N-morfolino)etánsulfónovej (MES) pri pH 5,5 a 6,0, aby sa pH znížilo na pH 6, respektíve 7.Konečná koncentrácia proteínu bola 100 mg/ml.
Merania sa uskutočňovali na spektrometri J-1500 CD (JASCO, USA) s použitím 300 μl kyvety s optickou dráhou 0,1 cm.Proteíny sa zriedili na 10 uM (n = 1) v 20 mM fosfátovom pufri (pH 8).Na analýzu stability proteínu v prítomnosti soli sa proteíny analyzovali v rovnakej koncentrácii (n = 1) v 20 mM fosfátovom pufri (pH 8) obsahujúcom 154 mM NaF alebo NaCI, v danom poradí.Teplotné skeny sa zaznamenávali pri 222 nm od 25 °C do 95 °C s rýchlosťou zahrievania 1 °C/min.Podiel natívne zložených proteínov sa vypočítal pomocou vzorca (KDmeasure – KDfinal)/(KDstart – KDfinal).Okrem toho bolo zaznamenaných päť spektier pre každú vzorku od 260 nm do 190 nm pri 25 °C a po zahriatí na 95 °C.Päť spektier bolo spriemerovaných, vyhladených a prevedených na molárnu elipticitu.Dáta sa analyzovali pomocou Prism 9.
Intenzita fluorescencie His-NT-GFP (300 mg/ml, 80 ul) sa merala trojmo (n = 3) v 96-jamkových platniach Corning s čiernym priehľadným dnom (Corning Glass 3881, USA) za statických podmienok.Vzorky zmerajte pomocou čítačky platní na báze fluorescencie s excitačnou vlnovou dĺžkou 395 nm a zaznamenajte emisiu pri 509 nm pred gélovatením a o 2 hodiny neskôr pri 37 °C.Dáta sa analyzovali pomocou Prism 9.
Súprava na testovanie aktivity purín nukleozid fosforylázy (fluorometrická metóda, Sigma Aldrich) bola použitá podľa pokynov výrobcu.Na meranie aktivity v géloch a roztokoch obsahujúcich His-NT-PNP zmiešajte 10 ng His-NT-PNP so 100 mg/ml NT na celkový objem 2 ul, pretože gél poskytoval signál nad detekčným intervalom súpravy.Boli zahrnuté kontroly pre gély a roztoky bez His-NT-PNP.Merania sa uskutočnili dvakrát (n = 2).Po zmeraní aktivity sa reakčná zmes odstránila a gél sa odfotografoval, aby sa zabezpečilo, že gél zostane počas merania neporušený.Dáta sa analyzovali pomocou Prism 9.
Viac informácií o dizajne štúdie nájdete v abstrakte štúdie Nature prepojenom s týmto článkom.
Obrázky 1 a 2 predstavujú počiatočné údaje.1c, 2a–c, 3a, b, e–g, 4, 5b, d, f a 6, doplnkové obrázky.3, doplnkový obr.5a, d, doplnkový obr.6 a doplnkový obr.8. Údaje Údaje z tejto štúdie sú umiestnené v databáze Zenodo https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653.Údaje NMR získané v tejto štúdii boli odoslané do úložiska BMRBig pod položkou ID bmrbig36.Štruktúry GFP a PNP boli prevzaté z PDB (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2).
Rising, A. a Johansson, J. Spinning umelého pavúčieho hodvábu.National Chemical.biológia.11, 309 – 315 (2015).
Babb, PL a kol.Genóm Nephila clavipes zdôrazňuje rozmanitosť génov pavúčieho hodvábu a ich komplexnú expresiu.Národná Genette.49, 895-903 (2017).