347 12,7 * 1,24 mm špirálová hadica z nehrdzavejúcej ocele, molekulárny mechanizmus synchrónnej elektrostatickej kondenzácie a koagregácie α-synukleínu a tau

Ďakujeme, že ste navštívili Nature.com.Používate verziu prehliadača s obmedzenou podporou CSS.Pre najlepší zážitok vám odporúčame použiť aktualizovaný prehliadač (alebo vypnúť režim kompatibility v programe Internet Explorer).Okrem toho, aby sme zabezpečili nepretržitú podporu, zobrazujeme stránku bez štýlov a JavaScriptu.
Posúvače zobrazujúce tri články na snímke.Na posúvanie medzi snímkami použite tlačidlá späť a ďalej, na posúvanie sa po jednotlivých snímkach použite tlačidlá ovládača posúvania na konci.

Špecifikácia potrubia z nehrdzavejúcej ocele 347

347 12,7*1,24mm Nerezová špirálová hadica

Vonkajší priemer: 6,00 mm vonkajší priemer až 914,4 mm vonkajší priemer, veľkosti do 24” NB dostupné zo skladu, vonkajší priemer Oceľové rúry dostupné zo skladu

Rozsah hrúbky rúr SS 347: 0,3 mm – 50 mm, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S atď. (0,5-12 mm) Alebo neštandardná veľkosť na prispôsobenie podľa potreby

Typ: Bezšvíkové rúry SS 347 |Rúry SS 347 ERW |SS 347 Zvárané rúry |Rúry SS 347 |Rúry SS 347 CDW, Rúry LSAW / švom zvárané / prekreslené

Tvar: SS 347 okrúhle rúry/rúrky, SS 347 štvorcové rúry/ rúry, SS 347 obdĺžnikové rúry/ rúry, SS 347 špirálové rúry, SS 347 „U“ tvar, SS 347 panvové cievky, SS 347 hydraulické rúry

Dĺžka: jednoduchý náhodný, dvojitý náhodný a koniec požadovanej dĺžky: hladký koniec, skosený koniec, behúň

Koncová ochrana: Plastové uzávery |Vonkajšia úprava: 2B, č. 4, č. 1, č. 8 Zrkadlová úprava pre rúry z nehrdzavejúcej ocele, úprava podľa požiadaviek zákazníka

Stav dodávky: žíhané a morené, leštené, žiarivo žíhané, ťahané za studena

Inšpekčné správy, protokoly o skúškach: Certifikáty mlynských skúšok, EN 10204 3.1, chemické správy, mechanické správy, správy o testoch PMI, správy o vizuálnych kontrolách, správy z inšpekcií tretích strán, laboratórne správy schválené NABL, správa o deštruktívnom teste, správy o nedeštruktívnych skúškach

Balenie: balené v drevených škatuliach, plastových vreciach, oceľových pásoch v balíku alebo podľa požiadaviek zákazníkov

Špeciálne: Veľkosti a špecifikácie iné ako vyššie uvedené môžu byť vyrobené na požiadanie

Rozsah veľkostí potrubia SS 347: 1/2 palca NB, vonkajší priemer až 24 palcov

ASTM A312 347: Bezšvíková austenitická rúra zváraná s rovným švom určená pre vysokoteplotné a všeobecné korozívne použitie.Prídavný kov nie je počas zvárania povolený.

ASTM A358 347: Austenitické rúrky zvárané elektrickým tavením pre korozívne a/alebo vysokoteplotné prevádzky.Typicky sa podľa tejto špecifikácie vyrába iba potrubie do 8 palcov.Pri zváraní je povolené pridávanie prídavného kovu.

ASTM A790 347: Bezšvíkové a rovným švom zvárané feritické/austenitické (duplexné) rúry určené pre všeobecné korózne použitie, s osobitným dôrazom na odolnosť voči koróznemu praskaniu pod napätím.

ASTM A409 347: austenitická svetlostenná rúra s priamym alebo špirálovým švom zváraná elektrickým tavením s veľkým priemerom vo veľkostiach 14” až 30” so stenami Sch5S a Sch 10S pre korozívne a/alebo vysoké

ASTM A376 347: Bezšvíkové austenitické potrubie pre vysokoteplotné aplikácie.

ASTM A813 347: Jednozvarové, jednoducho alebo dvojito zvárané austenitické rúry pre vysokoteplotné a všeobecné korozívne aplikácie.

ASTM A814 347: Za studena zvárané austenitické rúry pre vysokoteplotné a všeobecné korozívne služby.

Rúry z nehrdzavejúcej ocele 347H Chemické zloženie

Mechanické vlastnosti potrubia z nehrdzavejúcej ocele 347H

Rúry z nehrdzavejúcej ocele 347H Fyzikálne vlastnosti

Ekvivalentné triedy pre rúrky z nehrdzavejúcej ocele 347H

Agregácia amyloidného alfa-synukleínu (αS) je charakteristickým znakom Parkinsonovej choroby a iných synukleinopatií.Nedávno sa proteín tau bežne spojený s Alzheimerovou chorobou spájal s patológiou aS a zistilo sa, že sa ko-lokalizuje v inklúziách bohatých na aS, hoci molekulárny mechanizmus koagregácie týchto dvoch proteínov zostáva nejasný.Uvádzame tu, že fáza aS sa oddeľuje na kvapalné kondenzáty prostredníctvom elektrostatickej komplexnej kondenzácie s kladne nabitými polypeptidmi, ako je tau.V závislosti od afinity aS k polykatiónom a rýchlosti valenčnej deplécie koagulačnej siete zrazeniny podliehajú rýchlej gélovateniu alebo koalescencii, po ktorej nasleduje pomalá amyloidná agregácia.Kombináciou súboru pokročilých biofyzikálnych techník sme boli schopní charakterizovať fázovú separáciu kvapalina-kvapalina aS / Tau a identifikovať kľúčové faktory, ktoré vedú k vytvoreniu heterogénnych agregátov obsahujúcich oba proteíny v kvapalnom proteínovom kondenzáte.
Okrem membránových kompartmentov možno priestorovú separáciu v bunkách dosiahnuť aj tvorbou na proteíny bohatých, kvapaline podobných hustých teliesok nazývaných biomolekulové kondenzáty alebo kvapôčky, prostredníctvom procesu známeho ako separácia kvapalina-kvapalina (LLPS).Tieto kvapôčky sú tvorené multivalentnými dočasnými interakciami, zvyčajne medzi proteínmi alebo proteínmi a RNA, a slúžia rôznym funkciám takmer vo všetkých živých systémoch.Veľký počet proteínov schopných LLP vykazuje sekvencie nízkej komplexnosti, ktoré sú svojou povahou značne neusporiadané a pri tvorbe biomolekulárnych kondenzátov3,4,5.Početné experimentálne štúdie odhalili flexibilnú, často neusporiadanú a multivalentnú povahu proteínov, ktoré tvoria tieto tekuté kondenzáty, hoci je málo známe o špecifických molekulárnych determinantoch, ktoré riadia rast a dozrievanie týchto kondenzátov na pevnejšie. štát..
Nové údaje podporujú hypotézu, že aberantný proteínom riadený LLPS a transformácia kvapôčok na pevné štruktúry môžu byť relevantnými bunkovými dráhami vedúcimi k tvorbe nerozpustných toxických agregátov, ktoré sú často charakteristickým znakom degeneratívnych ochorení.Mnoho LLPS-asociovaných vnútorne neusporiadaných proteínov (IDP), často vysoko nabitých a flexibilných, bolo dlho spájaných s neurodegeneráciou prostredníctvom procesu amyloidnej agregácie.Konkrétne sa ukázalo, že biomolekulárne kondenzáty IDP, ako je FUS7 alebo TDP-438 alebo proteíny s veľkými doménami s nízkou komplexnosťou, ako je hnRNPA19, starnú do gélových alebo dokonca pevných foriem prostredníctvom procesu nazývaného fluidizácia.zlúčenina.na prechod na pevnej fáze (LSPT) ako funkciu času alebo ako odpoveď na určité posttranslačné modifikácie alebo patologicky významné mutácie1,7.
Ďalším IDP spojeným s LLPS in vivo je Tau, poruchový proteín spojený s mikrotubulami, ktorého amyloidná agregácia sa podieľa na Alzheimerovej chorobe10, ale nedávno sa podieľa aj na Parkinsonovej chorobe (PD) a iné synaptické jadrové proteinopatie 11, 12, 13 súvisia.Ukázalo sa, že Tau spontánne disociuje z roztoku/cytoplazmy v dôsledku priaznivých elektrostatických interakcií14, čo vedie k tvorbe kvapôčok obohatených o tau známych ako elektrostatické koacerváty.Bolo tiež pozorované, že tento typ nešpecifickej interakcie je hnacou silou mnohých biomolekulárnych kondenzátov v prírode15.V prípade tau proteínu môže byť elektrostatická agregácia vytvorená jednoduchou agregáciou, pri ktorej opačne nabité oblasti proteínu spúšťajú proces štiepenia, alebo komplexnou agregáciou prostredníctvom interakcie s negatívne nabitými polymérmi, ako je RNA.
Nedávno bol na bunkových a zvieracích modeloch preukázaný a-synukleín (αS), amyloidný IDP podieľajúci sa na PD a iných neurodegeneratívnych ochoreniach, ktoré sú súhrnne známe ako synukleinopatia17,18, koncentrované v proteínových kondenzátoch so správaním podobným tekutine.Štúdie in vitro ukázali, že αS podlieha LLPS jednoduchou agregáciou prostredníctvom prevažne hydrofóbnych interakcií, hoci tento proces vyžaduje mimoriadne vysoké koncentrácie proteínov a atypicky dlhé inkubačné časy19,21.Či sú kondenzáty obsahujúce aS pozorované in vivo tvorené týmto alebo inými procesmi LLPS, zostáva kľúčovým nevyriešeným problémom.Podobne, hoci agregácia aS amyloidu bola pozorovaná v neurónoch pri PD a iných synukleinopatiách, presný mechanizmus, ktorým aS podlieha intracelulárnej agregácii amyloidu, zostáva nejasný, pretože sa nezdá, že by nadmerná expresia tohto proteínu sama o sebe spúšťala tento proces.Často je potrebné ďalšie bunkové poškodenie, čo naznačuje, že na renukleáciu intracelulárnych aS amyloidových zostáv sú potrebné určité bunkové miesta alebo mikroprostredia.Jedno bunkové prostredie, ktoré je obzvlášť náchylné na agregáciu, môže byť vnútro proteínových kondenzátov23.
Je zaujímavé, že sa zistilo, že αS a tau sa spoločne lokalizujú v charakteristických inklúziách chorôb u ľudí s Parkinsonovou chorobou a inými synukleinopatiami 24, 25 a experimenty uvádzajú synergický patologický vzťah medzi týmito dvoma proteínmi 26, 27, čo naznačuje potenciálny vzťah medzi agregáciou αS a tau pri neurodegeneratívnych ochoreniach.choroba.Zistilo sa, že aS a tau interagujú a podporujú vzájomnú agregáciu in vitro a in vivo28,29 a v mozgoch pacientov so synukleinopatiami boli pozorované heterogénne agregáty zložené z týchto dvoch proteínov30.Málo sa však vie o molekulárnom základe interakcie medzi αS a tau a mechanizme ich spoločnej agregácie.Uvádza sa, že aS interaguje s tau prostredníctvom elektrostatickej príťažlivosti medzi vysoko negatívne nabitou C-koncovou oblasťou aS a centrálnou oblasťou tau bohatou na prolín, ktorá je tiež obohatená o pozitívne nabité zvyšky.
V tejto štúdii sme ukázali, že aS sa môže skutočne disociovať na kvapôčky prostredníctvom elektrostatickej komplexnej kondenzácie v prítomnosti tau proteínu, na rozdiel od jeho interakcie s inými pozitívne nabitými polypeptidmi, ako je poly-L-lyzín (pLK), a v tomto procese .αS pôsobí ako skafoldová molekula pre kvapôčkovú sieť.Identifikovali sme badateľné rozdiely v procese dozrievania elektrostatických αS koacervátov, ktoré sú spojené s rozdielmi vo valencii a sile interakcie proteínov zapojených do koacervátovej siete.Je zaujímavé, že sme pozorovali spoločnú agregáciu aS a tau amyloidných proteínov v kvapalných koacervátoch s dlhou životnosťou a identifikovali sme niektoré kľúčové faktory, ktoré vedú k spoločnej agregácii týchto dvoch proteínov v takýchto koacervátoch.Tu podrobne popisujeme tento proces, ktorý je možným molekulárnym mechanizmom, ktorý je základom kolokalizácie dvoch proteínov v inklúziách špecifických pre ochorenie.
αS má vysoko aniónový C-koncový koniec pri neutrálnom pH (obr. 1a) a predpokladali sme, že by mohol podstúpiť LLPS prostredníctvom kondenzácie elektrostatických komplexov s polykatiónovými neusporiadanými polypeptidovými molekulami.Použili sme 100-zvyškový poly-L-lyzín (pLK) ako východiskovú modelovú molekulu vďaka jej pozitívne nabitej a neusporiadanej polymérnej povahe pri neutrálnom pH 32. Najprv sme potvrdili, že pLK interaguje s Ct doménou αS prostredníctvom NMR spektroskopie v roztoku (Obrázok 1b) s použitím 13C/15N-značeného aS v prítomnosti zvyšujúcich sa molárnych pomerov aS:pLK.Interakcia pLK s Ct doménou αS sa prejavuje poruchami chemického posunu a znížením maximálnej intenzity v tejto oblasti proteínu.Je zaujímavé, že keď sme zmiešali αS s pLK v koncentrácii αS cca.5–25 µM v prítomnosti polyetylénglykolu (5–15 % PEG-8) (typický pufor LLPS: 10 mM HEPES pH 7,4, 100 mM NaCl, 15 % PEG-8) sme okamžite prešli širokým poľom tvorby proteínov .kvapôčky boli pozorované pomocou fluorescenčnej (WF) a mikroskopie v jasnom poli (BF) (obr. 1c).1-5 µm kvapôčky obsahujúce koncentrovaný αS (pridaný 1 µM AlexaFluor488-značený αS, AF488-αS), ich elektrostatické vlastnosti možno odvodiť z ich odolnosti voči 10 % 1,6-hexándiolu (1,6-HD) a jeho citlivosti na zvýšenie koncentrácie NaCl (obr. 1c).Tekutina podobná povaha koacervátov elektrostatického komplexu αS/pLK je demonštrovaná ich schopnosťou fúzovať v priebehu milisekúnd (obr. 1d).Pomocou turbidimetrie sme kvantifikovali tvorbu kvapiek za týchto podmienok, potvrdili sme elektrostatický charakter hlavnej interakcie spojenej s jej stabilitou (obr. 1e) a vyhodnotili sme vplyv rôznych pomerov polymérov na proces LLPS (obr. 1f).Hoci sa tvorba kvapiek pozoruje v širokom rozsahu pomerov polymérov, proces je veľmi priaznivý, keď je pLK v nadbytku aS.LLP boli tiež pozorované s použitím chemicky odlišného vytesňovacieho činidla dextránu-70 (70 kDa) alebo s použitím rôznych formátov vzoriek, vrátane kvapiek na sklenené podložné sklíčko, mikrotitračných jamiek z rôznych materiálov, Eppendorfových alebo kremenných kapilár.
a Schematické znázornenie rôznych proteínových oblastí vo variantoch WT-αS a ACt-αS použitých v tejto štúdii.Amfipatická N-koncová doména, hydrofóbna oblasť tvoriaca amyloid (NAC) a negatívne nabitá C-koncová doména sú znázornené modrou, oranžovou a červenou farbou.Je zobrazená mapa čistého poplatku za zvyšok (NCPR) WT-αS.b NMR analýza interakcie aS/pLK v neprítomnosti makromolekulových zhlukov.Ako sa koncentrácia pLK zvyšuje (molárne pomery aS:pLK 1:0,5, 1:1,5 a 1:10 sú znázornené svetlozelenou, zelenou a tmavozelenou farbou).c Koacervát αS/pLK (molárny pomer 1:10) pri 25 µM (1 µM AF488-značený aS alebo Atto647N-značený pLK pre WF zobrazovanie) v LLPS pufri (hore) alebo doplnený 500 mM NaCl (vľavo dole) alebo po 10 % 1,6-hexándiolu (1,6-HD; vpravo dole).Mierka = 20 um.d Reprezentatívne mikroskopické snímky BF kvapôčkovej fúzie aS/pLK (molárny pomer 1:10) pri koncentrácii 25 uM;šípky označujú zlúčenie jednotlivých kvapiek (červené a žlté šípky) do novej kvapky (oranžová šípka) v priebehu 200 ms) .Mierka = 20 um.e Rozptyl svetla (pri 350 nm) aS/pLK agregácia v LLPS tlmivom roztoku pred a po pridaní 500 mM NaCl alebo 10 % 1,6-HD pri 25 uM aS (N = 3 replikáty vzorky, je tiež uvedený priemer a štandardná odchýlka).f BF obraz (hore) a analýza rozptylu svetla (pri 350 nm, dole) agregácie aS/pLK pri 25 uM aS so zvyšujúcim sa molárnym pomerom aS:pLK (N = 3 replikáty vzorky, je tiež uvedená stredná a štandardná odchýlka).Mierka = 10 um.Mierka na jednom obrázku označuje mierku všetkých obrázkov na jednom paneli.Nespracované údaje sa poskytujú vo forme súborov s nespracovanými údajmi.
Na základe našich pozorovaní kondenzácie elektrostatického komplexu αS/pLK a predchádzajúcich pozorovaní αS ako klientskej molekuly kondenzátu tau/RNA prostredníctvom priamej interakcie s tau31 sme predpokladali, že αS a tau by mohli spolu segregovať s rozpúšťadlom v neprítomnosti RNA. kondenzácii.prostredníctvom elektrostatických komplexov a aS je skeletový proteín v koacervátoch aS/Tau (pozri distribúciu náboja tau na obrázku 2e).Zistili sme, že keď sa 10 μM aS a 10 μM Tau441 (obsahujúce 1 μM AF488-αS a 1 μM Atto647N-Tau, v uvedenom poradí) zmiešali v LLPS pufri, ľahko vytvorili proteínové agregáty obsahujúce obidva proteíny, ako je vidieť pomocou WF mikroskopie.(obr. 2a).Kolokalizácia dvoch proteínov v kvapkách bola potvrdená konfokálnou (CF) mikroskopiou (doplnkový obrázok 1a).Podobné správanie sa pozorovalo, keď sa ako agregačné činidlo použil dextrán-70 (doplnkový obrázok 1c).Použitím buď FITC-značeného PEG alebo dextránu sme zistili, že obe vytláčacie činidlá boli rovnomerne rozložené vo vzorkách, pričom nevykazovali ani segregáciu, ani asociáciu (doplnkový obrázok 1d).Skôr to naznačuje, že v tomto systéme podporujú fázovú separáciu prostredníctvom makromolekulárnych vytesňovacích účinkov, pretože PEG je prednostne stabilné vytláčacie činidlo, ako je vidieť v iných systémoch LLP33, 34.Tieto kvapôčky bohaté na proteín boli citlivé na NaCl (1 M), ale nie na 1,6-HD (10% v/v), čo potvrdzuje ich elektrostatické vlastnosti (doplnkový obrázok 2a, b).Ich tekuté správanie bolo potvrdené pozorovaním milisekundových udalostí spájania kvapiek pomocou BF mikroskopie (obr. 2b).
a Snímky konfokálnej (CF) mikroskopie aS/Tau441 koacervátov v LLPS pufri (10 uM každého proteínu, 0,5 uM aS značeného AF488 a Tau441 značeného Atto647N).b Reprezentatívne obrazy diferenciálneho interferenčného kontrastu (DIC) udalostí kvapkovej fúzie aS/Tau441 (10 uM pre každý proteín).c Fázový diagram založený na rozptyle svetla (pri 350 nm) Tau441 LLPS (0–15 µM) v neprítomnosti (vľavo) alebo prítomnosti (vpravo) 50 µM αS.Teplejšie farby naznačujú väčší rozptyl.d Rozptyl svetla vzoriek αS/Tau441 LLPS so zvyšujúcou sa koncentráciou αS (Tau441 pri 5 µM, N = 2–3 opakovania vzorky, ako je uvedené).e Schematické znázornenie niektorých variantov tau proteínu a rôznych oblastí proteínu použitých v tejto štúdii: negatívne nabitá N-terminálna doména (červená), oblasť bohatá na prolín (modrá), doména viažuca mikrotubuly (MTBD, zvýraznená oranžovou farbou) a párová špirála tvoriaca amyloid.oblasti vlákna (PHF) umiestnené v rámci MTBD (sivá).Je zobrazená mapa čistého poplatku za zvyšok (NCPR) Tau441.f Použitie 1 µM AF488-značeného αS a Atto647N-značeného ANt-, použitie 1 µM AF488-značeného αS alebo ACT-αS v prítomnosti ANt-Tau (hore, 10 µM na proteín) alebo K18 (dole, ) ) ) mikrofotografie WF kondenzovaného v LLPS alebo K18 pufri.Mierkové pruhy na jednom obrázku predstavujú mierku všetkých obrázkov na jednom paneli (20 µm pre panely a, b a f).Nespracované údaje pre panely c a d sa poskytujú ako súbory s nespracovanými údajmi.
Aby sme otestovali úlohu αS v tomto procese LLPS, najprv sme skúmali účinok αS na stabilitu kvapiek nefelometriou s použitím zvyšujúcich sa koncentrácií NaCl (obr. 2c).Čím vyššia je koncentrácia soli vo vzorkách obsahujúcich αS, tým vyššie sú hodnoty rozptylu svetla (pri 350 nm), čo naznačuje stabilizačnú úlohu αS v tomto systéme LLPS.Podobný účinok možno pozorovať zvýšením koncentrácie αS (a teda pomeru αS:Tau441) na cca.10-násobné zvýšenie v porovnaní s koncentráciou tau (5 uM) (obr. 2d).Aby sme demonštrovali, že αS je skeletový proteín v koacervátoch, rozhodli sme sa preskúmať správanie mutanta Tau s prerušením LLPS, ktorému chýba negatívne nabitá N-terminálna oblasť (zvyšky 1–150, pozri obr. 2e) nazývaná ΔNt-Tau.WF mikroskopia a nefelometria potvrdili, že samotný ΔNt-Tau nepodstúpil LLPS (obr. 2f a doplnkový obr. 2d), ako už bolo uvedené 14. Keď sa však do disperzných roztokov tohto skráteného variantu Tau pridal aS, proces LLPS bol úplne obnovené s hustotou kvapiek blízkou hustote kvapiek roztokov Tau a aS plnej veľkosti za podobných podmienok a koncentrácií proteínov.Tento proces je možné pozorovať aj v podmienkach nízkeho makromolekulárneho zhluku (doplnkový obrázok 2c).Úloha C-koncovej αS oblasti, ale nie celej jej dĺžky, v procese LLPS bola preukázaná inhibíciou tvorby kvapiek pomocou C-koncového skráteného αS variantu, ktorému chýbajú zvyšky 104–140 (obr. 1a) z (ACt- aS) proteín (obr. 2f a doplnkový obrázok 2d).Kolokalizácia aS a ANt-Tau bola potvrdená konfokálnou fluorescenčnou mikroskopiou (doplnkový obrázok 1b).
Na ďalšie testovanie mechanizmu LLPS medzi Tau441 a αS sa použil ďalší variant Tau, konkrétne fragment párového helikálneho vlákna (PHF) v doméne viažucej mikrotubuly (MTBD), ktorá, ak obsahuje štyri charakteristické opakujúce sa domény, bežne tiež známe. ako K18 fragment (pozri obr. 2e).Nedávno bolo publikované, že aS sa prednostne viaže na tau proteín lokalizovaný v doméne bohatej na prolín v sekvencii, ktorá predchádza doméne viažucej mikrotubuly.Oblasť PHF je však tiež bohatá na pozitívne nabité zvyšky (pozri obrázok 2e), najmä lyzín (15% zvyškov), čo nás podnietilo otestovať, či táto oblasť tiež prispieva ku kondenzácii komplexu aS / Tau.Zistili sme, že samotný K18 nemohol spustiť LLPS v koncentráciách do 100 uM za testovaných podmienok (tlmivý roztok LLPS s 15% PEG alebo 20% dextránom) (obrázok 2f).Keď sme však pridali 50 uM aS k 50 uM K18, nefelometriou (doplnkový obrázok 2d) a mikroskopiou WF (obrázok 2f) sa pozorovala rýchla tvorba proteínových kvapiek obsahujúcich K18 a aS.Ako sa očakávalo, ACt-αS nebol schopný obnoviť LLPS správanie K18 (obr. 2f).Poznamenávame, že agregácia αS/K18 vyžaduje na vyvolanie LLPS mierne vyššie koncentrácie proteínov v porovnaní s αS/ANt-Tau alebo αS/Tau441, pričom ostatné veci sú rovnaké.To je v súlade so silnejšou interakciou aS C-koncovej oblasti s doménou Tau bohatou na prolín v porovnaní s doménou viažucou mikrotubuly, ako už bolo opísané31.
Vzhľadom na to, že ΔNt-Tau nemôže vykonávať LLPS v neprítomnosti αS, vybrali sme tento variant Tau ako model na charakterizáciu αS / Tau LLPS vzhľadom na jeho jednoduchosť v systémoch LLPS s Tau s plnou dĺžkou (izotyp, Tau441 / Tau441).s komplexnými (heterotypickými, αS/Tau441) agregačnými procesmi.Porovnali sme stupeň agregácie αS (ako súčasť proteínu kondenzovanej fázy, fαS,c) v systémoch αS/Tau a αS/ΔNt-Tau centrifugáciou a analýzou SDS-PAGE v disperznej fáze (pozri 2e), našli sme veľmi podobné hodnoty pre všetky bielkoviny v rovnakej koncentrácii.Konkrétne sme získali faS,c 84 ± 2 % a 79 ± 7 % pre aS / Tau a aS / ANt-Tau, v uvedenom poradí, čo naznačuje, že heterotypická interakcia medzi aS a tau je lepšia ako interakcia medzi molekulami tau.medzi.
Interakcia s rôznymi polykatiónmi a vplyv kondenzačného procesu na kinetiku αS boli najprv študované metódou obnovy fluorescencie po fotobielení (FRAP).Testovali sme koacerváty aS/Tau441, aS/ANt-Tau a aS/pLK (100 uM aS doplnené s 2 uM aS AF488-αS a 100 uM Tau441 alebo ANt-Tau alebo 1 mM pLK).Údaje sa získali počas prvých 30 minút po zmiešaní zložiek vzorky.Z reprezentatívnych obrázkov FRAP (obr. 3a, kondenzácia αS / Tau441) a ich zodpovedajúcich kriviek časového priebehu (obr. 3b, doplnkový obrázok 3) je možné vidieť, že kinetika αS je veľmi podobná kinetike koacervátov Tau441.a ΔNt-Tau, ktorý je oveľa rýchlejší s pLK.Vypočítané difúzne koeficienty pre aS vo vnútri koacervátu podľa FRAP (ako opísali Kang et al. 35) sú D = 0,013 ± 0,009 µm2/sa D = 0,026 ± 0,008 µm2/s pre aS/Tau441 a Nt-aS/s systém αS/.pLK, Tau a D = 0,18 ± 0,04 um2/s, v danom poradí (obr. 3c).Difúzny koeficient αS v dispergovanej fáze je však o niekoľko rádov vyšší ako všetky kondenzované fázy, ako sa určilo pomocou fluorescenčnej korelačnej spektroskopie (FCS, pozri doplnkový obrázok 3) za rovnakých podmienok (tlmivý roztok LLPS), ale v neprítomnosti polykatiónov (D = 8 ± 4 um2/s).Preto je kinetika αS translácie v koacervátoch výrazne znížená v porovnaní s proteínmi v dispergovanej fáze v dôsledku výrazných účinkov zhlukovania molekúl, hoci všetky koacerváty si zachovávajú vlastnosti podobné kvapaline počas prvej pol hodiny po ich vytvorení, na rozdiel od fázy tau.rýchlejšej kinetiky v kondenzáte pLK.
a–c FRAP analýza dynamiky αS (2 % αS značená AF488) v elektrostatických koacervátoch.Reprezentatívne obrázky testov aS/Tau441 FRAP v troch vyhotoveniach sú uvedené v (a), kde červené kruhy označujú odfarbené oblasti.Mierka je 5 µm.b Priemerné krivky FRAP a (c) vypočítané difúzne koeficienty (D) pre 5–6 (N) rôznych kvapiek z troch experimentov s použitím 100 µM αS a ekvimolárnych koncentrácií Tau441 (červená) alebo ΔNt-Tau (modrá) alebo pLK (zelená) pri desaťnásobku koncentrácie LLPS.Štandardná odchýlka FRAP krivky je znázornená tieňovanou farbou.Na porovnanie sa difúzny koeficient aS v dispergovanej fáze stanovil trojmo pomocou fluorescenčnej korelačnej spektroskopie (FCS) (ďalšie informácie nájdete v doplnkovom obrázku 3 a metódach).d Kontinuálne X-pásmové EPR spektrá 100 μM TEMPOL-122-αS v LLPS pufri bez akéhokoľvek polykatiónu (čierna) alebo v prítomnosti 100 μM Tau441 (červená) alebo ΔNt-Tau (modrá) alebo 1 mM pLK (zelená).Vložka zobrazuje zväčšený pohľad na silné siločiary, kde dochádza k najdramatickejším zmenám.e Väzbové krivky 50 μM TEMPOL-122-αS s rôznymi polykatiónmi v neprítomnosti LLPS (bez PEG).Ukázalo sa, že znížená amplitúda pásma III v porovnaní s pásom II (IIII/III) normalizovaného spektra EPR zvyšuje molárne pomery Tau441 (červená), ANt-Tau (modrá) a pLK (zelená).Farebné čiary znázorňujú prispôsobenie údajom pomocou modelu hrubého viazania s n identickými a nezávislými väzbovými miestami na každej krivke.Nespracované údaje sa poskytujú vo forme súborov s nespracovanými údajmi.
Ako doplnok sme skúmali dynamiku aS v rôznych koacervátoch pomocou smerovaného spinového značenia (SDSL) a kontinuálnej elektrónovej paramagnetickej rezonancie (CW-EPR).Táto metóda sa ukázala ako veľmi užitočná pri vykazovaní flexibility a dynamiky IDP s realistickým reziduálnym rozlíšením36,37,38.Na tento účel sme skonštruovali cysteínové zvyšky v jednotlivých mutantoch Cys a použili sme spinovú sondu 4-hydroxy-2,2,6,6-tetrametylpiperidín-N-oxylu (TEMPOL).Deriváty maleimidu ich označujú.Konkrétnejšie sme vložili sondy TEMPOL do polohy 122 alebo 24 aS (TEMPOL-122-aS a TEMPOL-24-aS).V prvom prípade sa zameriavame na C-terminálnu oblasť proteínu, ktorá sa podieľa na interakcii s polykatiónmi.Namiesto toho nám pozícia 24 môže poskytnúť informácie o celkovej dynamike proteínov v kondenzáte.V oboch prípadoch EPR signály získané pre proteíny dispergovanej fázy zodpovedali nitroxidovým radikálom v rýchlo sa pohybujúcom stave.Po separácii fáz v prítomnosti tau alebo pLK (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 alebo ANt-Tau v pomere 1:1 alebo pLK v pomere 1:10) sa pozoroval nárast relatívnej intenzity vrcholu v EPR spektrum αS.Stratová čiara sa rozšírila, čo naznačuje zníženú kinetiku reorientácie αS v kvapkách v porovnaní s proteínom v zriedenej fáze (obr. 3d, doplnkový obrázok 4a).Tieto zmeny sú výraznejšie v polohe 122. Zatiaľ čo v polohe 24 prítomnosť pLK neovplyvnila kinetiku sondy, v polohe 122 sa tvar spektrálnej čiary výrazne zmenil (doplnkový obrázok 4a).Keď sme sa pokúsili modelovať spektrá na pozícii 122 dvoch systémov αS / polykatión pomocou izotropného modelu (doplnkový obrázok 5a), ktorý sa bežne používa na opis dynamiky spinovo značeného IDP38, 39, neboli sme schopní rekonštruovať experimentálne spektrá..Spektrálna simulácia polohy kontrastov 24 spinov (doplnkový obrázok 5a).To naznačuje, že existujú preferenčné polohy v priestore spinových konfigurácií C-koncovej oblasti aS v prítomnosti polykatiónov.Pri zvažovaní frakcie αS v kondenzovanej fáze za experimentálnych podmienok EPR (84 ± 2 %, 79 ± 7 % a 47 ± 4 % pre αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau a αS/pLK, v tomto poradí – pozri doplnkové Obr. 2e analýzy údajov c), je možné vidieť, že rozšírenie zistené metódou EPR odráža najmä interakciu C-terminálnej oblasti αS s rôznymi polykatiónmi v kondenzovanej fáze (hlavná zmena pri použití TEMPOL-122- aS), a nie kondenzáciu proteínov.V sonde sa pozoruje zvýšenie mikroviskozity.Ako sa očakávalo, spektrum EPR proteínu za iných podmienok ako LLPS sa úplne obnovilo, keď sa do zmesi pridal 1 M NaCl (doplnkový obrázok 4b).Celkovo naše údaje naznačujú, že zmeny zistené pomocou CW-EPR odrážajú hlavne interakciu C-terminálnej oblasti aS s rôznymi polykatiónmi v kondenzovanej fáze a táto interakcia sa zdá byť silnejšia s pLK ako s Tau.
Aby sme získali viac štruktúrnych informácií o proteínoch v koacerváte, rozhodli sme sa študovať systém LLPS pomocou NMR v roztoku.Mohli sme však detegovať iba frakciu aS zostávajúcu v dispergovanej fáze, čo môže byť spôsobené zníženou dynamikou proteínov vo vnútri koacervátu a hustou fázou na dne roztoku v NMR analýze.Keď sme analyzovali štruktúru a dynamiku proteínu zostávajúceho v dispergovanej fáze vzorky LLPS pomocou NMR (doplnkový obrázok 5c, d), všimli sme si, že proteín sa správa takmer identicky v prítomnosti pLK a ANt-Tau, oboch ktoré boli v sekundárnej štruktúre a dynamike proteínového hlavného reťazca, odhalené experimentmi na sekundárnom chemickom posune a relaxácii R1ρ.Údaje NMR ukazujú, že C-koniec aS trpí významnou stratou konformačnej flexibility, pričom si zachováva svoju neusporiadanú povahu, ako zvyšok proteínovej sekvencie, v dôsledku interakcií s polykatiónmi.
Pretože rozšírenie signálu CW-EPR pozorované v kondenzovanej fáze TEMPOL-122-αS odráža interakciu proteínu s polykatiónmi, vykonali sme titráciu EPR na vyhodnotenie väzbovej afinity aS k rôznym polykatiónom v neprítomnosti LLPS (žiadna akumulácia Pufer LLPS), čo naznačuje, že interakcie sú rovnaké v zriedených a koncentrovaných fázach (čo potvrdzujú naše údaje, doplnkový obrázok 4a a doplnkový obrázok 6).Cieľom bolo zistiť, či všetky koacerváty, napriek svojim bežným vlastnostiam podobným tekutine, vykazujú akékoľvek základné odlišné správanie na molekulárnej úrovni.Ako sa očakávalo, spektrum EPR sa rozšírilo so zvyšujúcou sa koncentráciou polykatiónu, čo odrážalo pokles molekulárnej flexibility v dôsledku molekulárnych interakcií všetkých interakčných partnerov takmer až do nasýtenia (obr. 3e, doplnkový obrázok 6).pLK dosiahol túto saturáciu pri nižšom molárnom pomere (polykatión:aS) v porovnaní s ANt-Tau a Tau441.V skutočnosti porovnanie údajov s približným väzbovým modelom za predpokladu n identických a nezávislých väzbových miest ukázalo, že zjavná disociačná konštanta pLK (~ 5 μM) je rádovo nižšia ako konštanta Tau441 alebo ANt-Tau (~ 50 μM ).uM).Aj keď ide o hrubý odhad, naznačuje to, že aS má vyššiu afinitu k jednoduchším polykatiónom s oblasťami súvislého kladného náboja.Vzhľadom na tento rozdiel v afinite medzi αS a rôznymi polykatiónmi sme predpokladali, že ich kvapalné vlastnosti sa môžu v priebehu času meniť odlišne, a teda trpieť rôznymi procesmi LSPT.
Vzhľadom na vysoko preplnené prostredie v rámci proteínového koacervátu a amyloidnú povahu proteínu sme pozorovali správanie koacervátu v priebehu času, aby sme zistili možné procesy LSPT.Pomocou mikroskopie BF a CF (obrázok 4) sme pozorovali, že αS / Tau441 do značnej miery koacervuje v roztoku, pričom vytvára veľké kvapôčky, ktoré sú v kontakte a zvlhčujú povrch na dne jamky / sklíčka ako plné kvapôčky, ako sa očakávalo (doplnkový obrázok 4). 7d);tieto štruktúry vytvorené na dne nazývame „bielkovinové rafty“.Tieto štruktúry zostali tekuté, pretože si zachovali schopnosť fúzie (doplnkový obrázok 7b) a bolo ich možné vidieť niekoľko hodín po spustení LLPS (obrázok 4 a doplnkový obrázok 7c).Zistili sme, že proces zmáčania je uprednostňovaný skôr na povrchu hydrofilných ako hydrofóbnych materiálov (doplnkový obrázok 7a), ako sa očakávalo pre elektrostatické koacerváty s nevyváženými nábojmi, a teda vysokými elektrostatickými povrchovými potenciálmi.Pozoruhodné je, že koalescencia a rafting αS/ANt-Tau sa výrazne znížili, zatiaľ čo kondenzáty αS/pLK sa výrazne znížili (obr. 4).Počas krátkeho inkubačného času sa kvapôčky αS/pLK dokázali spojiť a zmáčať hydrofilný povrch, ale tento proces sa rýchlo zastavil a po 5 hodinách inkubácie sa nepozorovali len obmedzené javy koalescencie a žiadne zmáčanie.– prechod gél-kvapkanie.
Reprezentatívne mikroskopické snímky BF (panely v odtieňoch sivej) a CF (pravé panely, AF488-značený aS v zelenej farbe) koacervátových vzoriek obsahujúcich 100 uM aS (1 % fluorescenčné označenie) v LLPS pufri v prítomnosti 100 uM fluorescencie Tau441 (hore) ΔNt -Tau (v strede) alebo 1 mM pLK (dole) pri rôznych inkubačných časoch a ohniskových výškach (z, vzdialenosť od dna jamky platne).Experimenty sa opakovali 4-6 krát nezávisle od seba s rovnakými výsledkami.Koacerváty αS/Tau441 sa zmáčajú po 24 hodinách a vytvárajú rafty väčšie ako na obrázku.Mierka pre všetky obrázky je 20 µm.
Potom sme sa opýtali, či veľké zásoby proteínov podobné tekutine vytvorené v αS / Tau441 LLPS povedú k amyloidnej agregácii ktoréhokoľvek zo študovaných proteínov.Sledovali sme dozrievanie kvapôčok αS/Tau441 v priebehu času pomocou WF mikroskopie za rovnakých podmienok ako vyššie, ale s použitím 1 uM αS značeného AF488 a Tau441 značeného Atto647N (obr. 5a).Ako sa očakávalo, pozorovali sme úplnú lokalizáciu proteínu počas procesu dozrievania.Zaujímavé je, že od cca.Po 5 hodinách boli vo vnútri raftov pozorované intenzívnejšie nekruhové štruktúry, ktoré sme nazývali „body“, z ktorých niektoré boli kolokalizované s αS a niektoré boli obohatené o Tau441 (obr. 5a, biele šípky).Tieto škvrny boli vždy pozorované v raftoch vo väčšej miere pre αS/ANt-Tau ako pre αS/ANt-Tau.V kvapôčkach systémov pLK a Tau neboli žiadne zreteľné škvrny nekompetentné na fúziu/zmáčanie.Aby sme otestovali, či sú tieto škvrny obsahujúce aS a Tau441 agregáty podobné amyloidu, uskutočnili sme podobný experiment s použitím CF mikroskopie, v ktorej bol Tau441 označený Atto647N a od začiatku bolo pridané 12,5 μM amyloid-špecifického tioflavínu-T (ThT).farbivo.Hoci ThT farbenie kvapôčok alebo raftov αS/Tau441 nebolo pozorované ani po 24 hodinách inkubácie (obr. 5b, horný riadok – zostávajúce kvapôčky nad proteínovými raftmi), ThT-pozitívne štruktúry obsahujúce Atto647N-Tau441 vo vnútri raftov boli veľmi slabé.toto kopíruje veľkosť, tvar a umiestnenie predtým opísaných škvŕn (obr. 5b, stredný a spodný riadok), čo naznačuje, že škvrny môžu zodpovedať agregátom podobným amyloidu vytvoreným v koacervátoch starnúcej tekutiny.
WF 25 μM αS v rôznych inkubačných časoch a ohniskových výškach (z, vzdialenosť od neviazaného dna) v prítomnosti 25 μM Tau441 (1 μM αS značený AF488 a Tau441 značený Atto647N) v jamke mikroskopickej platne s tlmivým roztokom LLPS) .Šesť experimentov sa nezávisle opakovalo s podobnými výsledkami.b CF mikroskopický obraz 25 uM aS v prítomnosti 25 uM Tau441 (1 uM Atto647N-značený Tau441) a 12,5 uM tioflavín-T (ThT).V hornom a strednom riadku sú zobrazené vážené proteínové kvapky a usadené proteínové rafty a škvrny.Spodný riadok zobrazuje obrázky raftov a dropov z 3 nezávislých replikátov.Biele šípky označujú ThT-pozitívne bodky na oboch paneloch.Mierka pre všetky obrázky je 20 µm.
Na podrobnejšie preskúmanie zmien v koacervátovej proteínovej sieti počas prechodu z kvapaliny na pevnú látku sme použili fluorescenčné celoživotné zobrazovanie (FLIM) a Försterovu rezonančnú mikroskopiu prenosu energie (FRET) (obrázok 6 a doplnkové obrázky 8 a 9).Predpokladali sme, že koacervátové dozrievanie vrstvy do kondenzovanejšej alebo dokonca pevnejšej agregovanej proteínovej štruktúry vedie k užšiemu kontaktu medzi proteínom a fluorescenčnou sondou, ktorá je k nemu pripojená, čo potenciálne vedie k zhášaciemu efektu prejavujúcemu sa v skrátenej životnosti sondy (τ) ako je opísané vyššie40.,41,42.Okrem toho, pre dvojito značené vzorky (AF488 a Atto647N ako FRET donorové a akceptorové farbivá, v danom poradí), môže byť tento pokles τ sprevádzaný aj koacervátovou kondenzáciou a zvýšením účinnosti FRET(E) počas LSPT.Monitorovali sme tvorbu raftov a škvŕn v priebehu času vo vzorkách LLPS aS/Tau441 a aS/ANt-Tau (25 uM každého proteínu v LLPS pufri obsahujúcom 1 uM AF488 značeného aS a/alebo Atto647N značeného Tau441 alebo ANt-Tau).Pozorovali sme všeobecný trend v tom, že životnosť fluorescencie sond AF488 (τ488) a Atto647N (τ647N) sa mierne znížila, keď koacerváty dozrievali (obr. 6 a doplnkový obrázok 8c).Je zaujímavé, že táto zmena bola výrazne zvýšená pre bodky v raftoch (obr. 6c), čo naznačuje, že v bodkách došlo k ďalšej kondenzácii proteínov.Na podporu toho nebola pozorovaná žiadna významná zmena v životnosti fluorescencie pre kvapôčky αS/ANt-Tau starnuté 24 hodín (doplnkový obrázok 8d), čo naznačuje, že gélovanie kvapôčok je proces odlišný od bodovania a nie je sprevádzaný významnou molekulárnou reorganizáciou v rámci koacervátov.Treba poznamenať, že bodky majú rôzne veľkosti a variabilný obsah v αS, najmä pre systém αS / Tau441 (doplnkový obrázok 8e).Zníženie životnosti bodovej fluorescencie bolo sprevádzané zvýšením intenzity, najmä pre Tau441 označenú Atto647N (doplnkový obrázok 8a), a vyššou účinnosťou FRET pre systémy αS/Tau441 aj αS/ANt-Tau, čo naznačuje ďalšiu kondenzáciu v LLPS Päť hodín po spustení sa proteíny vo vnútri statickej elektriny skondenzovali.V porovnaní s αS/ΔNt-Tau sme pozorovali nižšie hodnoty τ647N a o niečo vyššie hodnoty τ488 v bodoch αS/Tau441, sprevádzané nižšími a nehomogénnymi hodnotami FRET.Možno to môže súvisieť so skutočnosťou, že v systéme αS / Tau441 je pozorovaná a očakávaná abundancia αS v agregátoch heterogénnejšia, často substechiometrická v porovnaní s Tau, pretože samotná Tau441 môže tiež podliehať LLPS a agregácii (doplnkový obrázok 8e) .Stupeň koalescencie kvapiek, tvorby raftov a, čo je dôležité, agregácie proteínov v koacervátoch podobných kvapaline je však maximálny, keď sú prítomné Tau441 aj aS.
a celoživotné snímky fluorescenčnej mikroskopie (FLIM) αS/Tau441 a αS/ANt-Tau pri 25 μM každého proteínu (1 μM AF488-označený aS a 1 μM Atto647N-označený Tau441 alebo ANLLPS-Tau) v tlmivom roztoku ANLLPS.Stĺpce zobrazujú reprezentatívne obrázky vzoriek LLPS v rôznych časoch dozrievania (30 minút, 5 hodín a 24 hodín).Červený rámik zobrazuje oblasť obsahujúcu škvrny αS/Tau441.Životnosť je znázornená ako farebné pruhy.Mierka = 20 µm pre všetky obrázky.b Priblížený obrázok FLIM vybranej oblasti zobrazený v červenom rámčeku na paneli a.Rozsahy životnosti sú zobrazené pomocou rovnakej farebnej škály ako na paneli a.Mierka = 5 um.c Histogramy znázorňujúce AF488 (pripojený k αS) alebo Atto647N (pripojený k Tau) pre rôzne druhy proteínov (kvapôčky-D-, raft-R- a bodkované-P) identifikované na snímkach FLIM zaznamenaných pre αS-) časovanie distribúcie životnosti Tau441 a Vzorky koacervátov aS/ANt-Tau (N = 17-32 ROI pre D, 29-44 ROI pre R a 21-51 ROI pre body).Stredné a stredné hodnoty sú zobrazené ako žlté štvorce a čierne čiary v rámčekoch.Dolná a horná hranica rámčeka predstavuje prvý a tretí kvartil a minimálne a maximálne hodnoty v rámci 1,5-násobku medzikvartilového rozsahu (IQR) sú zobrazené ako fúzy.Odľahlé hodnoty sú zobrazené ako čierne diamanty.Štatistická významnosť medzi pármi distribúcií bola stanovená pomocou dvojvýberového t-testu za predpokladu nerovnakých rozptylov.Dvojstranné p-hodnoty t-testu sú zobrazené s hviezdičkami pre každý pár porovnávaných údajov (* p-hodnota > 0,01, ** p-hodnota > 0,001, *** p-hodnota > 0,0001, **** p-hodnota > 0,00001), ns Označuje zanedbateľnosť (p-hodnota > 0,05).Presné hodnoty p sú uvedené v doplnkovej tabuľke 1 a pôvodné údaje sú prezentované ako súbory s nespracovanými údajmi.
Aby sme ďalej demonštrovali amyloidnú povahu škvŕn/agregátov, ošetrili sme nezafarbené vzorky koacervátov počas 24 hodín vysokými koncentráciami (1 M) NaCl, čo viedlo k oddeleniu agregátov od proteínových koacervátov.Keď boli izolované agregáty (tj dispergovaný roztok agregátov) pozorované pomocou mikroskopie atómovej sily (AFM), pozorovali sme prevažne sférickú morfológiu s pravidelnou výškou okolo 15 nm, ktorá má tendenciu sa spájať v podmienkach vysokej koncentrácie soli, podobne ako správanie typických amyloidných fibríl v dôsledku silného hydrofóbneho účinku na povrchu (všimnite si, že fibrily majú zvyčajne výšku ~ 10 nm) (doplnkový obrázok 10a).Je zaujímavé, že keď sa izolované agregáty inkubovali s ThT v štandardnom fluorescenčnom teste ThT, pozorovali sme dramatický nárast kvantového výťažku fluorescencie ThT, porovnateľný s tým, ktorý sa pozoroval, keď sa farbivo inkubovalo s typickými aS amyloidnými vláknami (doplnkový obrázok 10b), čo naznačuje, že koacervátové agregáty obsahujú štruktúry podobné amyloidu..V skutočnosti boli agregáty tolerantné voči vysokým koncentráciám soli, ale citlivé na 4 M guanidínchlorid (GdnHCl), ako typické amyloidné fibrily (doplnkový obrázok 10c).
Ďalej sme analyzovali zloženie agregátov pomocou fluorescencie jednej molekuly, špecifickej fluorescenčnej korelačnej/krížovej korelačnej spektroskopie (FCS/FCCS) a zhlukovej analýzy dvojfarebnej koincidenčnej detekcie (TCCD).Za týmto účelom sme izolovali agregáty vytvorené po 24 hodinách inkubácie v 100 ul LLPS vzorkách obsahujúcich aS a Tau441 (obe 25 μM) spolu s 1 μM aS značeným AF488 a 1 μM Tau441 značeným Atto647N.Výsledný roztok dispergovaného agregátu zrieďte do monomolekulárneho stavu s použitím rovnakého tlmivého roztoku bez PEG a 1 M NaCl (rovnaký tlmivý roztok používaný na oddelenie agregátov od koacervátu), aby ste zabránili akýmkoľvek možným elektrostatickým interakciám medzi LLPS a proteínom.Príklad časovej trajektórie jednej molekuly je možné vidieť na obr. 7a.FCCS/FCS analýza (krížová korelácia, CC a autokorelácia, AC) ukázala, že agregáty obsahujúce aS a tau boli vo vzorkách hojné (pozri krivku CC na obr. 7b, ľavý panel) a prebytok zvyškového monomérneho proteínu vznikol ako výsledok procesu riedenia (pozri krivky AC na obrázku 7b, ľavý panel).Kontrolné experimenty uskutočnené za rovnakých podmienok roztoku s použitím vzoriek obsahujúcich len monomérne proteíny neukázali žiadne CC krivky a AC krivky dobre sedia s jednozložkovým difúznym modelom (Rov. 4), kde monomérne proteíny majú očakávané difúzne koeficienty (obr. 7b). ), pravý panel).Difúzny koeficient agregovaných častíc je menší ako 1 µm2/s a difúzny koeficient monomérnych proteínov je približne 1 µm2/s.50-100 um/s;hodnoty sú podobné predtým publikovaným hodnotám pre sonikované αS amyloidné fibrily a monomérne αS oddelene za podobných podmienok roztoku44.Keď sme agregáty analyzovali analýzou výbuchu TCCD (obr. 7c, horný panel), zistili sme, že v každom izolovanom agregáte (aS/Tau heteroagregát) asi 60 % detekovaných agregátov obsahovalo αS aj tau, asi 30 % obsahovalo iba tau, len asi 10 % αS.Stechiometrická analýza heteroagregátov αS/Tau ukázala, že väčšina heteroagregátov bola obohatená o tau (stechiometria pod 0,5, priemerný počet molekúl tau na agregát je 4-krát viac ako molekúl αS), čo je v súlade s našou prácou pozorovanou v FLIM in situ experimenty..FRET analýza ukázala, že tieto agregáty obsahovali oba proteíny, aj keď skutočné hodnoty FRET v tomto prípade nie sú veľmi dôležité, pretože distribúcia fluorofórov v každom agregáte bola náhodná v dôsledku nadbytku neznačeného proteínu použitého v experimente.Je zaujímavé, že keď sme vykonali rovnakú analýzu s použitím 45,46 zrelého variantu Tau s deficitom agregácie amyloidu (pozri doplnkový obrázok 11a, b), všimli sme si, že hoci elektrostatická agregácia αS bola rovnaká (doplnkový obrázok 11c, d), schopnosť tvoriť agregáty v koacerváte bola drasticky znížená a FLIM detegoval niekoľko miest v experimentoch in situ a slabé krížové korelačné krivky boli pozorované pre izolované vzorky agregátov.Avšak pre malý počet detegovaných agregátov (iba jednu desatinu Tau441) sme pozorovali, že každý agregát bol obohatený o αS ako tento variant Tau, pričom približne 50 % detegovaných agregátov obsahovalo iba molekuly αS a αS bol v prebytku heterogénny. .agregáty (pozri doplnkový obrázok 11e), na rozdiel od heterogénnych agregátov generovaných Tau441 (obr. 6f).Výsledky týchto experimentov ukázali, že hoci samotný aS je schopný akumulovať sa s tau v koacerváte, nukleácia tau je za týchto podmienok priaznivejšia a výsledné agregáty podobné amyloidu sú schopné pôsobiť ako forma aS a tau.Akonáhle sa však vytvorí jadro bohaté na tau, heterotypické interakcie medzi aS a tau sú uprednostňované v agregátoch pred homotypickými interakciami medzi molekulami tau;pozorujeme aj proteínové siete v tekutých koacervátoch αS/tau.
a Reprezentatívne fluorescenčné časové stopy jednotlivých molekúl izolovaných agregátov vytvorených v elektrostatických koacervátoch aS/Tau441.Výbuchy zodpovedajúce koagregátom αS/Tau441 (výbuchy nad uvedenou prahovou hodnotou) boli pozorované v troch detekčných kanáloch (emisia AF488 a Atto647N po priamej excitácii, modrá a červená čiara, emisia Atto647N po nepriamej excitácii), FRET, fialová čiara).b FCS/FCCS analýza vzorky izolovaných agregátov aS/Tau441 získaných z LLPS (ľavý panel).Autokorelačné (AC) krivky pre AF488 a Atto647N sú zobrazené modrou a červenou farbou a krivky krížovej korelácie (CC) spojené s agregátmi obsahujúcimi obe farbivá sú znázornené fialovou farbou.AC krivky odrážajú prítomnosť značených monomérnych a agregovaných proteínových druhov, zatiaľ čo CC krivky ukazujú iba difúziu dvojito značených agregátov.Rovnaká analýza, ale za rovnakých podmienok roztoku ako v izolovaných bodoch, vzorky obsahujúce iba monomérne aS a Tau441 sú zobrazené ako kontroly na pravom paneli.c Fluorescenčná blesková analýza jednotlivých molekúl izolovaných agregátov vytvorených v elektrostatických koacervátoch αS/Tau441.Informácie pre každý agregát nájdený v štyroch rôznych opakovaniach (N = 152) sú vynesené do grafu oproti ich stechiometrii, hodnotám S a účinnosti FRET (horný panel, farebný pruh odráža výskyt).Je možné rozlíšiť tri typy agregátov: -aS-iba agregáty s S~1 a FRET~0, Tau-iba agregáty s S~0 a FRET~1 a heterogénne Tau/αS agregáty so strednými S a FRET Odhady množstva oboch markerových proteínov detegovaných v každom heterogénnom agregáte (N = 100) sú zobrazené v dolnom paneli (výskyt odráža farebná škála).Nespracované údaje sa poskytujú vo forme súborov s nespracovanými údajmi.
Uvádza sa, že dozrievanie alebo starnutie tekutých proteínových kondenzátov do gélových alebo pevných štruktúr v priebehu času sa podieľa na niekoľkých fyziologických funkciách kondenzátu47, ako aj na chorobe, ako abnormálny proces predchádzajúci agregácii amyloidu 7, 48, 49. podrobne študujeme fázovú separáciu a správanie.LSPT aS v prítomnosti náhodných polykatiónov v kontrolovanom prostredí pri nízkych mikromolárnych koncentráciách a fyziologicky relevantných podmienkach (všimnite si, že vypočítaná fyziologická koncentrácia aS je > 1 µM50), po typickom termodynamicky riadenom správaní LPS.Zistili sme, že αS, ktorý obsahuje vysoko negatívne nabitú C-koncovú oblasť pri fyziologickom pH, je schopný vytvárať kvapôčky bohaté na proteíny vo vodnom roztoku prostredníctvom LLPS v prítomnosti vysoko katiónových neusporiadaných peptidov, ako sú pLK alebo Tau, prostredníctvom elektrostatického procesu. komplexná kondenzácia v prítomnosti agregačných makromolekúl.Tento proces môže mať relevantné účinky v bunkovom prostredí, kde sa aS stretáva s rôznymi polykatiónovými molekulami spojenými s jeho agregáciou spojenou s ochorením in vitro aj in vivo51, 52, 53, 54.
V mnohých štúdiách sa dynamika proteínov v kvapkách považovala za jeden z kľúčových faktorov určujúcich proces dozrievania55,56.V elektrostatických αS koacervátoch s polykatiónmi proces zrenia zjavne závisí od sily interakcií s polykatiónmi, valencie a mnohosti týchto interakcií.Teória rovnováhy naznačuje, že rovnovážnou krajinou dvoch kvapalných stavov by bola prítomnosť veľkej kvapky bohatej na biopolyméry, ktoré poháňajú LLPS57,58.Rast kvapiek možno dosiahnuť Ostwaldovým zrením59, koalescenciou60 alebo spotrebou voľného monoméru v dispergovanej fáze61.Pre aS a Tau441, ANt-Tau alebo pLK bola väčšina proteínu koncentrovaná v kondenzáte za podmienok použitých v tejto štúdii.Avšak zatiaľ čo kvapôčky tau v plnej veľkosti sa rýchlo zlúčili po zmáčaní povrchu, koalescencia kvapôčok a zmáčanie boli pre ANt-Tau a pLK ťažké, čo naznačuje rýchlu stratu vlastností kvapaliny v týchto dvoch systémoch.Podľa našej analýzy FLIM-FRET staré kvapôčky pLK a ANt-Tau vykazovali podobný stupeň agregácie proteínov (podobná životnosť fluorescencie) ako pôvodné kvapôčky, čo naznačuje, že pôvodná proteínová sieť bola zachovaná, aj keď pevnejšia.
Naše experimentálne výsledky racionalizujeme v nasledujúcom modeli (obrázok 8).Pôvodne dočasne vytvorené kvapôčky sú často proteínové siete bez elektrostatickej kompenzácie, a preto existujú oblasti nerovnováhy náboja, najmä na rozhraní kvapiek, čo vedie k kvapkám s vysokým elektrostatickým povrchovým potenciálom.Aby sa kompenzoval náboj (fenomén bežne označovaný ako deplécia valencie) a minimalizoval sa povrchový potenciál kvapôčok, kvapôčky môžu zahŕňať nové polypeptidy zo zriedenej fázy, reorganizovať proteínové siete na optimalizáciu interakcií náboj-náboj a interagovať s inými kvapôčkami.s povrchmi (zmáčanie).Zdá sa, že kvapôčky aS/pLK sú vďaka svojej jednoduchšej proteínovej sieti (iba heterotypické interakcie medzi aS a pLK) a väčšej afinite k interakciám proteín-proteín schopné rýchlejšie vyrovnať náboj kondenzátu;skutočne sme pozorovali rýchlejšiu kinetiku proteínov v pôvodne vytvorených koacervátoch aS / pLK ako v aS / Tau.Po valenčnom vyčerpaní sa interakcie stávajú menej efemérne a kvapôčky strácajú svoje tekuté vlastnosti a menia sa na gélovité, nehorľavé kvapôčky s nízkym elektrostatickým povrchovým potenciálom (a preto nie sú schopné zmáčať povrch).Naproti tomu kvapôčky αS/Tau sú menej účinné pri optimalizácii rovnováhy náboja kvapôčok v dôsledku zložitejších proteínových sietí (s homotypickými aj heterotypickými interakciami) a slabšej povahy proteínových interakcií.To má za následok kvapôčky, ktoré si zachovávajú správanie kvapaliny počas predĺženého časového obdobia a vykazujú vysoký elektrostatický povrchový potenciál, ktorý má tendenciu byť minimalizovaný koalescenciou a rastom (čím sa minimalizuje pomer povrchovej plochy/objemu kvapiek) a zmáčaním hydrofilného povrchu chem.To vytvára veľké koncentrované proteínové knižnice, ktoré si zachovávajú tekuté vlastnosti, pretože interakcie zostávajú veľmi prechodné v dôsledku neustáleho hľadania optimalizácie náboja v proteínovej sieti.Je zaujímavé, že N-terminálne skrátené formy Tau, vrátane niektorých prirodzene sa vyskytujúcich izoforiem62, vykazujú prechodné správanie, pričom niektoré koacerváty starnú s aS na gélovité kvapôčky s dlhou životnosťou, zatiaľ čo iné sa transformujú na veľké kvapalné kondenzáty.Táto dualita v dozrievaní aS elektrostatických koacervátov je v súlade s nedávnymi teoretickými a experimentálnymi štúdiami LLPS, ktoré identifikovali koreláciu medzi depléciou valencie a elektrostatickým preosievaním v kondenzátoch ako kľúč k riadeniu veľkosti kondenzátu a vlastností tekutín.Mechanizmus 58,61.
Táto schéma ukazuje predpokladanú dráhu agregácie amyloidu pre aS a Tau441 prostredníctvom LLPS a LSPT.S ďalšími oblasťami bohatými na anióny (červené) a bohaté na katióny (modré) majú elektrostatické koacerváty αS a tau s uspokojivou valenciou nižšiu povrchovú energiu, a preto menšiu koalescenciu, čo vedie k rýchlemu starnutiu kvapiek.Dosiahne sa stabilný neaglomerovaný gélový stav..Táto situácia je veľmi priaznivá v prípade systému αS/pLK vďaka jeho vyššej afinite a jednoduchšej interakčnej sieti proteín-pár, ktorá umožňuje rýchly gélovitý prechod.Naopak, kvapôčky s neuspokojivou valenciou, a teda oblasťami nabitými proteínmi dostupnými pre interakciu, uľahčujú koacervátom fúziu a zvlhčenie hydrofilného povrchu, aby sa znížila jeho vysoká povrchová energia.Táto situácia je výhodnejšia pre koacerváty aS/Tau441, ktoré majú multivalentnú komplexnú sieť pozostávajúcu zo slabých interakcií Tau-Tau a aS-Tau.Na druhej strane väčšie koacerváty si ľahšie zachovajú svoje vlastnosti podobné tekutine, čo umožní, aby sa vyskytli ďalšie interakcie proteín-proteín.Nakoniec sa v koacervátovej tekutine tvoria amyloidné heterogénne agregáty obsahujúce aS aj tau, ktoré môžu súvisieť s tými, ktoré sa nachádzajú v inklúznych telieskach, čo sú charakteristické znaky neurodegeneratívnych ochorení.
Veľké štruktúry podobné tekutine vytvorené počas dozrievania aS / Tau441 s vysoko preťaženým, ale dynamickým proteínovým prostredím a v menšej miere koacerváty aS / ANt-Tau sú ideálnymi rezervoármi na nukleáciu agregácie proteínov.Skutočne sme pozorovali tvorbu pevných proteínových agregátov v tomto type proteínových koacervátov, ktoré často obsahujú aS aj tau.Ukázali sme, že tieto heteroagregáty sú stabilizované neelektrostatickými interakciami, sú schopné viazať amyloidovo špecifické ThT farbivá rovnakým spôsobom ako typické amyloidné fibrily a skutočne majú podobnú odolnosť voči rôznym vplyvom.Ukázalo sa, že agregáty aS/tau tvorené LLPS majú vlastnosti podobné amyloidu.V skutočnosti je zrelý variant Tau deficitný v agregácii amyloidu výrazne narušený pri tvorbe týchto heterogénnych agregátov aS v kvapalnom elektrostatickom koacerváte.Tvorba agregátov aS/Tau441 sa pozorovala iba vo vnútri koacervátov, ktoré si zachovali vlastnosti podobné kvapaline, a nikdy, ak koacerváty/kvapôčky nedosiahli gélový stav.V druhom prípade zvýšená sila elektrostatických interakcií a v dôsledku toho tuhosť proteínovej siete bráni nevyhnutným konformačným preskupeniam proteínov na vytvorenie nových proteínových interakcií potrebných na nukleáciu amyloidu.To sa však dá dosiahnuť pružnejšími koacervátmi podobnými kvapaline, ktoré naopak s väčšou pravdepodobnosťou zostanú tekuté, keď sa zväčšia.
Skutočnosť, že tvorba agregátov v kondenzovanej fáze je výhodnejšia vo veľkých kondenzátoch aS/Tau ako v malých kvapôčkach, ktoré rýchlo gélujú, zdôrazňuje dôležitosť identifikácie faktorov, ktoré riadia koalescenciu kvapiek.Existuje teda nielen tendencia k separácii fáz, ale pre správne fungovanie a prevenciu chorôb musí byť kontrolovaná aj veľkosť kondenzátu58,61.Naše výsledky tiež zdôrazňujú dôležitosť rovnováhy medzi LLPS a LSPT pre systém αS/Tau.Zatiaľ čo tvorba kvapiek môže chrániť pred agregáciou amyloidu znížením množstva proteínových monomérov dostupných v podmienkach nasýtenia, ako bolo navrhnuté v iných systémoch63, 64, fúzia kvapiek pri vysokých hladinách kvapiek môže viesť k vnútornej agregácii proteínov prostredníctvom pomalých konformačných preskupení.proteínové siete..
Celkovo naše údaje silne zdôrazňujú význam kohéznej valencie a spokojných / nespokojných interakcií v drop sieťach v kontexte LSPT.Konkrétne sme ukázali, že kondenzáty aS / Tau441 s plnou dĺžkou sú schopné účinne fúzovať a nukleovať za vzniku heteroagregátov podobných amyloidu, ktoré zahŕňajú oba proteíny a navrhujú molekulárny mechanizmus založený na našich experimentálnych výsledkoch.Spoločná agregácia dvoch proteínov v tekutom koacerváte αS/Tau, ktorú tu uvádzame, môže skutočne súvisieť so spoločnou lokalizáciou dvoch proteínov v inklúziách, ktoré sú charakteristickým znakom choroby, a môže prispieť k pochopeniu vzťahu medzi LLPS a agregácia amyloidu, čím sa pripravuje pôda pre vysoko nabitý IDP v neurodegenerácii.
Monomérne WT-αS, cysteínové mutanty (Q24C-αS, N122C-αS) a varianty ACt-αS (A101-140) boli exprimované v E. coli a purifikované, ako bolo opísané vyššie.5 mM DTT bolo zahrnuté vo všetkých krokoch pri čistení aS cysteínových mutantov, aby sa zabránilo tvorbe disulfidových väzieb.Izoforma Tau441 (plazmid získaný z Addgene #16316), variant ANt-Tau (Δ1–150, získaný klonovaním IVA s primérmi CTTTAAGAAGGAGATACATATGATCGCCACACCGCGG, CATATGTATATCCTCTCTTCTTAAAGTAAAC purifikovaný s primérom GΔG1Ta5, variant AggDef.51Ta5 kultúry boli pestované na OD600 = 0,6–0,7 pri 37 °C a 180 ot./min. a expresia sa indukovala pomocou IPTG počas 3 hodín pri 37 °C.Zozbierajte bunky pri 11 500 xg počas 15 minút pri 4 °C a premyte fyziologickým roztokom obsahujúcim 150 mM NaCl.Resuspendujte peletu v lyzovacom pufri (20 ml na 1 1 LB: MES 20 mM, pH 6,8, NaCI 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0,2 ​​mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, benzamidín 50 μM10 μM).Krok sonikácie sa uskutočnil na ľade s amplitúdou 80 % počas 10 impulzov (1 minúta zapnutá, 1 minúta vypnutá).Neprekračujte 60 ml pri jednom ultrazvuku.Lyzáty E. coli sa zahrievali na 95 °C počas 20 minút, potom sa ochladili na ľade a centrifugovali pri 127 000 x g počas 40 minút.Vyčírený supernatant bol aplikovaný na 3,5 kDa membránu (Spectrum™ Thermo Fisher Scientific, UK) a dialyzovaný proti 4 1 dialyzačného pufra (20 mM MES, pH 6,8, NaCI 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, DTT 2 mM PMSF 0,1 mM) počas 10 hodín.5 ml katexová kolóna (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, USA) bola ekvilibrovaná ekvilibračným pufrom (20 mM MES, pH 6,8, 50 mM NaCI, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0,1 mM PMSF).Tau lyzát sa prefiltroval cez 0,22 um PVDF filter a vstrekol sa do kolóny pri prietokovej rýchlosti 1 ml/min.Elúcia sa uskutočňovala postupne, tau sa eluoval 15-30% elučným pufrom (20 mM MES, pH 6,8, 1 M NaCI, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0,1 mM PMSF).Frakcie sa analyzovali pomocou SDS-PAGE a akékoľvek frakcie obsahujúce jeden pás s očakávanou molekulovou hmotnosťou tau sa skoncentrovali pomocou 10 kDa centrifugačného filtra a nahradili sa pufrom obsahujúcim 10 mM HEPES, pH 7,4, NaCI 500 mM a DTT 2 mM pre konečná koncentrácia proteínu bola 100 uM.Proteínový roztok potom prešiel cez 0,22 um PVDF filter, rýchlo sa zmrazil a skladoval pri -80 °C.Proteín K18 láskavo poskytol Prof. Alberto Boffi.Čistota prípravku bola >95 %, ako bolo potvrdené SDS-PAGE a MALDI-TOF/TOF.Rôzne cysteíny boli chemicky označené AlexaFluor488-maleimidom (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) alebo TEMPOL-maleimidom (Toronto Research Chemicals, Toronto, Kanada).boli potvrdené absorbanciou a MALDI-TOF/TOF.Tau441, ANt-Tau, AggDef-Tau a K18 boli označené natívnymi cysteínovými zvyškami v pozíciách 191 a 322 pomocou Atto647N-maleimidu (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Nemecko) podľa rovnakého postupu.Mapy čistého náboja na zvyšok pre aS a Tau441 boli vytvorené pomocou CIDER66.
Pevný poly-L-lyzín (pLK DP 90-110 podľa NMR od dodávateľa, Alamanda Polymers Inc, Huntsville, Alabama, USA) bol rozpustený v 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 7,4 až 10 mM koncentrácia, proces sonikovaný počas 5 minút v ultrazvukovom vodnom kúpeli a skladujte pri -20°C.PEG-8, dextrán-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, USA) a FITC-dextrán-500 (Sigma-Aldrich, Sant Louis, MI, USA) sú vo vode rozpustné a široko distribuované v LLPS pufri.Dialýza odstraňuje kontaminujúce soli.Potom sa prefiltrovali cez striekačkový filter s veľkosťou pórov 0,22 μm a ich koncentrácie sa vypočítali pomocou refraktometra (Mettler Toledo, Columbus, Ohio, USA).Vzorky LLPS sa pripravili pri teplote miestnosti v nasledujúcom poradí: pufor a extrúzia sa zmiešali a 1 mM tris(2-karboxyetyl)fosfín (TCEP, Carbosynth, Compton, UK), 1 mM 2,2,2,2-(etán- kyselina 1,2-diyldinitril)tetraoctová (EDTA, karboxynth) a zmes 1% inhibítora proteázy (PMSF 100 mM, benzimid 1 mM, leupeptín 5 uM).Potom sa pridajú aS a kondenzované polykatióny (možnosti pLK alebo Tau).Pre experimenty s časovým radom tioflavínu-T (ThT, Carbosynth, Compton, UK) použite celkovú koncentráciu ThT tak, aby bola polovičnou koncentráciou aS.Jemne, ale dôkladne premiešajte vzorky, aby ste sa uistili, že sú homogénne.Koncentrácia každej zložky sa líšila od experimentu k experimentu, ako je opísané v časti Výsledky.Azid sa použil v koncentrácii 0,02 % (w/v) vždy, keď trvanie experimentu presiahlo 4 hodiny.Pri všetkých analýzach s použitím vzoriek LLPS nechajte zmes pred analýzou ekvilibrovať 5 minút.Na analýzu rozptylu svetla sa 150 ul vzoriek nanieslo na neväzbové 96-jamkové mikrodoštičky (uClear®, čierna, F-Bottom/Chimney Well, Greiner bio-one, Kremsmünster, Rakúsko) a prekryli adhéznym filmom.LLP boli monitorované meraním absorbancie pri 350 nm v strede roztoku v čítačke platní CLARIOstar (BMG Labtech, Ortenberg, Nemecko).Experimenty sa uskutočnili trojmo pri 25 °C a chyby sa vypočítali ako štandardná odchýlka od priemeru.Zriedená fáza sa kvantifikovala centrifugáciou vzorky a gélovou analýzou SDS-PAGE a frakcia aS v zriedenej a koncentrovanej fáze sa kvantifikovala v rôznych roztokoch LLPS.Vzorka 100 ul LLPS obsahujúca 1 uM AF488-značený aS sa pripravila dôkladným premiešaním, po ktorom nasledovala centrifugácia pri 9600 x g počas 30 minút, po ktorej bola zrazenina zvyčajne viditeľná.Horných 50 ul supernatantu sa použilo na kvantifikáciu proteínu pomocou gélu SDS-PAGE.Gély sa skenovali pomocou filtrov AF488 pomocou gélového zobrazovacieho systému ChemiDoc (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) alebo sa farbili Coomassie farbivom a vizualizovali sa vhodnými filtrami.Výsledné pásy sa analyzovali pomocou ImageJ verzie 1.53i (National Institutes of Health, USA).Experimenty sa uskutočnili duplicitne v dvoch rôznych experimentoch s podobnými výsledkami.
Typicky sa 150 μl vzoriek nanieslo na neväzbové 96-jamkové mikrodoštičky a vizualizovalo sa pri teplote miestnosti na inverznom mikroskope Leica DMI6000B (Leica Microsystems, Wetzlar, Nemecko).Na bodové experimenty boli tiež použité doštičky u-Slide Angiogenesis (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Nemecko) alebo 96-jamkové polystyrénové mikrodoštičky (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts).Ako zdroje osvetlenia sa použili halogénové alebo ortuťové výbojky EL6000 (pre BF/DIC a WF zobrazovanie).Pre WF mikroskopiu sa použil vzduchový objektív so 40-násobným zväčšením (Leica Microsystems, Nemecko) na zaostrenie svetla na vzorku a jej zber.V prípade vzoriek označených AF488 a ThT excitácia a emisia pomocou štandardných GFP filtrov, excitačných a emisných pásmových filtrov, 460–500 nm a 512–542 nm pásmových filtrov a 495 nm dichroického zrkadla.Pre vzorky označené Atto647N sa použila štandardná sada filtrov Cy5 s excitačnými a emisnými pásmovým filtrom 628–40 nm a 692–40 nm a dichroické zrkadlo 660 nm.Pre mikroskopiu BF a DIC použite rovnaký objektív na zber odrazeného svetla.Zozbierané svetlo bolo zaznamenané na CCD kamere Leica DFC7000 (Leica Microsystems, Nemecko).Expozičný čas bol 50 ms pre BF a DIC mikroskopické zobrazovanie a 20-100 ms pre WF mikroskopické zobrazovanie.Pre porovnanie, expozičný čas pre všetky experimenty s ThT bol 100 ms.Uskutočnili sa časozberné experimenty na vizualizáciu koalescencie kvapiek, pričom obrázky sa zbierali každých 100 ms počas niekoľkých minút.Na analýzu obrazu sa použil ImageJ (NIH, USA).Experimenty sa uskutočnili trojmo s podobnými výsledkami.
Pre kolokalizačné experimenty, FRAP a 3D rekonštrukciu sa snímky získali na inverznom konfokálnom mikroskope Zeiss LSM 880 s použitím modrého vydania ZEN 2 (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Nemecko).Vzorky s objemom 50 ul sa aplikovali na Petriho misky µ-Slide Angiogenesis (Ibidi GmbH, Gröfelfing, Nemecko), ošetrili sa hydrofilným polymérom (ibiTreat) a umiestnili sa do objektívu s 63x olejovou imerziou (Plan-Apochromat 63x/NA 1,4 Oil) na DIC).Obrázky boli získané pomocou argónových laserových línií 458 nm, 488 nm a 633 nm s rozlíšením 0,26 µm/pixel a expozičným časom 8 µs/pixel pre okná detekcie excitácie a emisie 470–600 nm, 493–628 nm, a 638–755 nm sa použili na vizualizáciu ThT, AF488 a Atto647N.Pre experimenty FRAP bola časozberná fotografia každej vzorky zaznamenaná pri 1 snímke za sekundu.Experimenty sa uskutočnili trojmo pri teplote miestnosti s podobnými výsledkami.Všetky obrázky boli analyzované pomocou softvéru Zen 2 blue edition (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Nemecko).Krivky FRAP boli normalizované, vynesené a prispôsobené údajom intenzity/času extrahovaných z obrázkov pomocou Zen 2 s použitím OriginPro 9.1.Krivky výťažnosti boli prispôsobené monoexponenciálnemu modelu, aby sa zohľadnila molekulárna difúzia s ďalším exponenciálnym výrazom, ktorý zohľadnil účinok akvizičného bielenia.Potom sme vypočítali D pomocou nominálneho polomeru bielenia a predtým stanoveného polčasu regenerácie ako v rovnici Kang et al.5 35 zobrazené.
Jednotlivé cysteínové varianty aS boli syntetizované s 4-hydroxy-2,2,6,6-tetrametylpiperidín-N-oxylom (TEMPOL) v pozíciách 24 (TEMPOL-24-aS) a 122 (TEMPOL-122-aS), resp.Značenie spinom Pre experimenty EPR bola koncentrácia aS nastavená na 100 uM a koncentrácia PEG bola 15 % (w/v).Pre rôzne podmienky agregácie bol pomer aS:pLK 1:10, zatiaľ čo pomery aS:ANt-Tau a aS:Tau441 boli udržiavané na 1:1.Pre experimenty s väzbovou titráciou v neprítomnosti nahromadenia sa TEMPOL-122-αS udržiaval na 50 uM a polykatióny sa titrovali pri zvyšujúcich sa koncentráciách, pričom sa každá podmienka pripravila samostatne.Merania CW-EPR sa uskutočnili pomocou spektrometra Bruker ELEXSYS E580 X-band vybaveného rezonátorom Bruker ER4118 SPT-N1 pracujúcim pri mikrovlnnej (SHF) frekvencii ~9,7 GHz.Teplota bola nastavená na 25 °C a riadená kryostatom s kvapalným dusíkom.Spektrá boli získané za nenasýtených podmienok pri MW výkone 4 mW, modulačnej amplitúde 0,1 mT a modulačnej frekvencii 100 kHz.Spektrálne intenzity boli normalizované, aby sa predišlo rozdielom v koncentráciách spinov medzi vzorkami a možnému zníženiu spinu v dôsledku zvyškových koncentrácií redukčných činidiel vo vzorkách obsahujúcich Tau441 alebo ANt-Tau (prítomné v pôvodných proteínových roztokoch).Uvedené hodnoty g boli získané ako výsledok EPR spektrálneho modelovania uskutočneného pomocou softvéru Easyspin (v. 6.0.0-dev.34) implementovaného v Matlab®67.Na modelovanie údajov boli použité jedno/dvojzložkové izotropné modely.Po normalizácii všetkých signálov sa rezíduá vypočítali odčítaním každej simulácie od zodpovedajúceho experimentálneho spektra.Na analýzu titrácie väzby sa použila relatívna intenzita tretieho pásu k druhému pásu normalizovaného EPR spektra (IIII/III) na monitorovanie väzby polykatiónov na aS.Na odhadnutie disociačnej konštanty (Kd) bola výsledná krivka prispôsobená približnému modelu za predpokladu n identických a nezávislých väzbových miest.
Experimenty NMR spektroskopie sa uskutočňovali s použitím spektrometra Bruker Neo 800 MHz (1H) NMR vybaveného kryosondou a Z-gradientom.Všetky experimenty sa uskutočnili s použitím 130–207 uM aS a zodpovedajúcich ekvivalentov aS/ANt-Tau a pLK v 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10 % DO, pH 7,4 a uskutočňovali sa pri 15 °C.Na monitorovanie LPS pomocou NMR sa do vopred zmiešaných vzoriek pridalo 10 % PEG.Graf porúch chemického posunu (obr. 1b) ukazuje priemerné chemické posuny 1H a 15N.aS 2D1H-15N HSQC spektrá boli priradené na základe predchádzajúceho priradenia (BMRB položka #25227) a potvrdené záznamom a analýzou 3D spektier HNCA, HNCO a CBCAcoNH.Chemické posuny 13Ca a 13Cp sa vypočítali v prítomnosti ANt-Tau alebo pLK na meranie možných zmien v trendoch sekundárnej štruktúry v porovnaní s chemickými posunmi aS v konformácii čistej náhodnej cievky 68 (doplnkový obrázok 5c).Rýchlosti R1ρ sa merali zaznamenaním experimentov hsqctretf3gpsi (získaných z knižnice Bruker) s oneskoreniami 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400 a 800 ms a exponenciálne funkcie boli upravené na oneskorenia maximálnej intenzity pri rôznych časov na určenie R1ρ a jej experimentálnej neistoty.
Experimenty dvojfarebnej časovo rozlíšenej fluorescenčnej mikroskopie sa uskutočnili na komerčnom časovo rozlíšenom fluorescenčnom konfokálnom mikroskope MT200 (PicoQuant, Berlín, Nemecko) s časovo korelovaným zariadením na počítanie fotónov (TCSPC).Hlava laserovej diódy sa používa na pulzne prekladanú excitáciu (PIE), lúč prechádza cez jednovidový vlnovod a je naladený na výkon lasera 10 až 100 nW pre 481 nm a 637 nm laserové čiary merané po dichroickom zrkadle.To zaisťuje optimálnu rýchlosť počítania fotónov, čím sa zabráni účinkom aliasingu fotónov, fotobielenia a saturácie.Krycie sklíčka alebo platničky na angiogenézu μ-Slide (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Nemecko) sa umiestnili priamo do ponornej vody cez šošovku Super Apochromat 60x NA 1.2 s korekčným golierom (Olympus Life Sciences, Waltham, USA).Ako rozdeľovač hlavného lúča sa použilo 488/640 nm dichroické zrkadlo (Semrock, Lake Forest, IL, USA).Nezaostrené žiarenie je blokované otvorom s priemerom 50 mikrónov, následne je zaostrené žiarenie rozdelené na 2 detekčné dráhy rozdeľovačom lúčov 50/50.Pred detektorom boli použité pásmové emisné filtre (Semrock, Lake Forest, IL, USA) 520/35 pre zelené farbivo (AF488) a 690/70 pre červené farbivo (Atto647N).Ako detektory boli použité jednofotónové lavínové diódy (SPAD) (Micro Photon Devices, Bolzano, Taliansko).Zber údajov aj analýza sa uskutočnili pomocou komerčne dostupného softvéru SymphoTime64 (PicoQuant GmbH, Berlín, Nemecko).
Päťdesiat mikrolitrov vzoriek LLPS sa aplikovalo do jamiek angiogenézy μ-Slide (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Nemecko).Výsledné snímky sú zaostrené do 20 µm nad dnom jamky pre optimálnu objektívnu pracovnú vzdialenosť pre zavesené kvapôčky a do ~1 µm pre rafty a bodky s axiálnym rozlíšením aspoň 0,25 µm/pixel a oneskorením 400 µs/pixel.Vyberte údaje aplikovaním prahu intenzity na základe priemernej intenzity signálu pozadia (PBG, priemer + 2σ) pre každý kanál tak, že sa vyberú iba kvapky tekutého proteínu, rafty alebo škvrny, čím sa odfiltruje akýkoľvek možný pôvod z rozptýlenej fázy.Aby sme analyzovali životnosť každého druhu (τ) každého kanála (zelená, „g“ pre AF488 a červená, „r“ pre Atto647N), vybrali sme oblasti záujmu (ROI) obsahujúce kvapôčky, plte alebo škvrny (doplnkový obrázok 1 ).8b) a odvodili ich prispôsobením ich rozpadu počas životnosti (τD, τR a τP pre kvapôčky, plte alebo škvrny, pozri doplnkový obrázok 8c) v každom kanáli pomocou analýzy prispôsobenia chvosta a dvojzložkového modelu rozpadu.Priemer τ z τ .ROI, ktoré produkovali príliš málo fotónov pre multi-exponenciálne prispôsobenie, boli z analýzy vylúčené.Použitá hranica bola <104 fotónov pre rafty a bodky a 103 pre kvapky.Kvapky majú nižší prah, pretože je ťažké získať krivky rozpadu s vyššími hodnotami intenzity, pretože kvapky v obrazovom poli sú zvyčajne menšie a menej početné.Oblasti záujmu s počtom fotónov nad limitom akumulácie fotónov (nastaveným na > 500 impulzov/pixel) boli tiež vyradené na analýzu.Porovnajte krivku poklesu intenzity získanú z oblasti záujmu s intenzitou na 90 % maxima (mierne po maximálnej intenzite poklesu) od začiatku životnosti, aby ste zabezpečili minimálne rušenie IRF pri zachovaní rovnakého pre všetky poklesy intenzity nastavenia Relatívne časové okno Analyzovalo sa 25 až 50 ROI pre rafty a škvrny a 15-25 ROI pre kvapky, obrázky vybrané z viac ako 4 replikátov zaznamenaných z najmenej 3 nezávislých experimentov.Na vyhodnotenie štatistických rozdielov medzi druhmi alebo medzi koacervátovými systémami sa použili dvojstranné t-testy.Pre analýzu doby životnosti (τ) pixel po pixeli sa vypočítal celkový útlm životnosti v priebehu poľa pre každý kanál a vykonala sa aproximácia 2/3-zložkového modelu exponenciálneho útlmu.Útlm počas životnosti pre každý pixel bol potom prispôsobený pomocou predtým vypočítaných hodnôt τ, čo viedlo k prispôsobeniu obrazu pseudocolor FLIM.Rozsah životnosti uloženia chvosta bol rovnaký na všetkých obrázkoch toho istého kanála a každý rozpad produkoval dostatok fotónov na zabezpečenie spoľahlivého prispôsobenia.Na analýzu FRET sa pixely vybrali aplikáciou nižšej prahovej hodnoty intenzity 100 fotónov, ktorá spriemerovala signál pozadia (FBG) 11 fotónov.Intenzita fluorescencie každého kanála bola korigovaná experimentálne stanovenými korekčnými faktormi: 69 spektrálny presluch α bol 0,004, priama excitácia β bola 0,0305, účinnosť detekcie γ bola 0,517.Účinnosť FRET na úrovni pixelov sa potom vypočíta pomocou nasledujúcej rovnice:
kde FDD je intenzita fluorescencie pozorovaná v donorovom (zelenom) kanáli, FDA je intenzita fluorescencie pozorovaná v akceptorovom (červenom) kanáli pri nepriamej excitácii a FAA je intenzita fluorescencie pozorovaná v akceptorovom (červenom) kanáli pri priamej excitácii ( PIE).Pulzy intenzity fluorescencie sú pozorované v kanáli).
Umiestnite 100 ul reakčných roztokov LLPS obsahujúcich 25 uM neznačeného monomérneho Tau441 (s alebo bez 25 uM aS) do LLPS pufra (doplneného ako je uvedené vyššie) na neväzbové 96-jamkové mikrodoštičky s adhéznou fóliou a tvorba kvapôčok sa skontrolovala pomocou WF mikroskopie po ekvilibrácia.do 10 min.Po 48 hodinách inkubácie pri teplote miestnosti bola potvrdená prítomnosť proteínových raftov a škvŕn.Potom opatrne odstráňte kvapalinu cez rafty z jamiek, potom pridajte 50 1 disociačného pufra (10 mM HEPES, pH 7,4, 1 M NaCl, 1 mM DTT) a inkubujte 10 minút.Vysoká koncentrácia soli zaisťuje, že LLPS sa nebude opakovať kvôli zvyškovému PEG a prípadné proteínové zostavy tvorené len elektrostatickými interakciami budú rozložené.Dno jamky sa potom opatrne zoškrabalo špičkou mikropipety a výsledný roztok sa preniesol do prázdnej pozorovacej jamky.Po inkubácii vzoriek s 50 uM ThT počas 1 hodiny sa prítomnosť izolovaných škvŕn skontrolovala pomocou WF mikroskopie.Pripravte sonikované aS fibrily inkubáciou 300 ul 70-uM roztoku aS v PBS s pH 7,4, azid sodný 0,01 % pri 37 °C a 200 ot./min. na orbitálnej trepačke počas 7 dní.Roztok sa potom centrifugoval pri 9600 x g počas 30 minút, peleta sa resuspendovala v PBS pH 7,4 a sonikovala (1 minúta, 50 % cyklus, 80 % amplitúda v sonikátore Vibra-Cell VC130, Sonics, Newton, USA) vzorky fibríl s relatívne rovnomernou distribúciou veľkosti malých fibríl.
Analýza FCS/FCCS a detekcia dvojfarebnej koincidencie (TCCD) sa uskutočňovali na rovnakom časovo rozlíšenom fluorescenčnom konfokálnom mikroskope MT200 (Pico-Quant, Berlín, Nemecko), ktorý sa používa na mikroskopické experimenty FLIM-FRET s použitím režimu PIE.Výkon lasera pre tieto experimenty bol pridaný na 6,0 uW (481 nm) a 6,2 uW (637 nm).Kombinácia týchto výkonov lasera bola zvolená tak, aby produkovala podobný jas pre použité páry fluorofórov, pričom sa dosiahli optimálne počty impulzov a zabránilo sa fotobieleniu a saturácii.Zber údajov aj analýza sa uskutočnili pomocou komerčne dostupného softvéru SymphoTime64 verzie 2.3 (PicoQuant, Berlín, Nemecko).
Vzorky izolovaných agregátov aS/Tau získaných pomocou LLPS sa zriedia v izolačnom pufri na vhodnú monomolekulárnu koncentráciu (zvyčajne riedenie 1:500, pretože agregáty už majú nízke koncentrácie, keď sa izolujú z koacervátových vzoriek).Vzorky sa aplikovali priamo na krycie sklíčka (Corning, USA) vopred potiahnuté roztokom BSA v koncentrácii 1 mg/ml.
Pre analýzu PIE-smFRET v zelených a červených kanáloch sa použil nižší prah intenzity 25 fotónov na odfiltrovanie signálov nízkej intenzity spôsobených monomérnymi udalosťami (všimnite si, že počet monomérov prevyšuje agregované vzorky v porovnaní s izolovanými agregátmi).Tento prah sa vypočítal ako päťnásobok priemernej intenzity monomérneho aS získanej z analýzy vzoriek čistého monoméru, aby sa špecificky vybrali agregáty na analýzu.Obvod pohonu PIE spolu so získavaním údajov TSCPC umožnili použitie celoživotného váhového filtra, ktorý pomáha eliminovať presluchy pozadia a spektrálne presluchy.Intenzita vzplanutia vybraná pomocou vyššie uvedených prahových hodnôt bola korigovaná s použitím priemerného signálu pozadia určeného z histogramov výskytu verzus intenzita/zásobník vzoriek obsahujúcich iba pufor.Výbuchy spojené s veľkými agregátmi zvyčajne zaberajú niekoľko po sebe idúcich zásobníkov v časovej stope (nastavené na 1 ms).V týchto prípadoch bol zvolený kôš s maximálnou pevnosťou.Pre FRET a stechiometrickú analýzu bol použitý teoreticky stanovený gama faktor γ (0,517).Príspevky spektrálneho presluchu a priamej excitácie sú zanedbateľné (určené experimentálne) pri použitom výkone excitačného lasera.Účinnosť a stechiometria FRET pri výbuchu sa vypočítajú nasledovne.