347 chemická zložka vinutých hadičiek z nehrdzavejúcej ocele, Identifikácia nových chaperónových proteínov ľudského leukocytového antigénu-A (HLA-A) reagujúcich na interferón pomocou zosieťovanej hmotnostnej spektrometrie (CLMS)

Ďakujeme, že ste navštívili Nature.com.Používate verziu prehliadača s obmedzenou podporou CSS.Pre najlepší zážitok vám odporúčame použiť aktualizovaný prehliadač (alebo vypnúť režim kompatibility v programe Internet Explorer).Okrem toho, aby sme zabezpečili nepretržitú podporu, zobrazujeme stránku bez štýlov a JavaScriptu.
Posúvače zobrazujúce tri články na snímke.Na posúvanie medzi snímkami použite tlačidlá späť a ďalej, na posúvanie sa po jednotlivých snímkach použite tlačidlá ovládača posúvania na konci.

Popis produktu

Rúrky z nehrdzavejúcej ocele 347L, Kvalita ocele: SS347L

Interferónový signálny systém indukuje silnú cytokínovú odpoveď na širokú škálu patogénnych a vnútorných patologických signálov z prostredia, čo vedie k indukcii podskupín interferónom indukovateľných proteínov.Použili sme DSS-sprostredkovanú krížovú hmotnostnú spektrometriu (CLMS) na detekciu nových interakcií proteín-proteín v doméne proteínov indukovaných interferónom.Okrem očakávaných proteínov indukovateľných interferónom sme tiež identifikovali nové intermolekulárne a intramolekulárne zosieťované adukty kanonických proteínov indukovateľných interferónom, ako sú MX1, USP18, OAS3 a STAT1.Zamerali sme sa na ortogonálnu validáciu nového súboru interferónom indukovateľných proteínových sietí tvorených HLA-A proteínmi (H2BFS-HLA-A-HMGA1) pomocou koimunoprecipitácie a ich ďalšie štúdium pomocou modelovania molekulárnej dynamiky.Modelovanie konformačnej dynamiky proteínového komplexu odhalilo niekoľko interakčných miest, ktoré odrážali interakcie identifikované v nálezoch CLMS.Spoločne predstavujeme pilotnú štúdiu CLMS na identifikáciu nových signálnych komplexov indukovaných interferónom a tešíme sa na širšie využitie CLMS na identifikáciu novej dynamiky proteínových interakcií v mikroprostredí nádoru.
Predtým, ako začne adaptívna imunitná odpoveď, vrodený obranný systém hostiteľa spustí antimikrobiálnu odpoveď sprostredkovanú rodinou vylučovaných alfa-helikálnych cytokínov nazývaných interferóny (IFN).Triedy IFN IFNa a IFNp aktivujú bunkové reakcie, vrátane antivírusových, proapoptotických, prozápalových a antiproliferatívnych stavov.U ľudí je známych 13 podtypov IFNa, všetky sú zoskupené na chromozóme 91. Prekvapivo sa klinicky študoval iba IFNa2.V poslednej dobe sa osobitná pozornosť venuje výskumu iných podtypov IFNα.Nedávna štúdia ukázala, že IFNa14 je jednou z najúčinnejších izoforiem pri obmedzovaní replikácie HBV2 a HIV-13,4 v porovnaní s kanonickým podtypom IFNa2.
Zistilo sa, že aktivované komplexy interferónového receptora typu I (IFNAR1 a IFNAR2) spúšťajú signálnu transdukčnú kaskádu sprostredkovanú Janusovými kinázami TYK2 a JAK15,6.Tieto Janus kinázy fosforylujú signálne prevodníky a aktivátory transkripčných proteínov (STAT1 a STAT2) na tyrozínových zvyškoch, aby iniciovali heterodimerizáciu sprostredkovanú doménou SH26.Následne IRF9 viaže STAT heterodiméry za vzniku trimérneho komplexu IFN-stimulovaného génu faktora 3 (ISGF3), ktorý sa translokuje do jadra a indukuje transkripciu viac ako 2000 interferónom stimulovaných génov (ISG)5,6,7,8.
ISG tvoria chrbticu vrodeného imunitného systému, najmä v reakcii na vírusový útok.Ako prvá línia obrany proti vírusovej infekcii bunky rýchlo využívajú rozsiahle interakcie bunkových proteínov so širokým rozsahom biologických aktivít.Tieto proteíny zahŕňajú receptory rozpoznávajúce vzory, signálne molekuly, transkripčné faktory a proteíny s priamymi antivírusovými funkciami, ako aj negatívne regulátory imunitných reakcií9.Veľká časť informácií o aktivite ISG pochádza z funkčných skríningov pomocou skríningov nadmernej expresie10,11 alebo techník umlčania génov (siRNA, RNAi a CRISPR)12,13, v ktorých sa jednotlivé ISG exprimujú alebo inhibujú a ich aktivita sa testuje na rôznych vírusoch.Hoci tieto štúdie určili antivírusové vlastnosti jednotlivých ISG, základné molekulárne mechanizmy každého ISG zostávajú do značnej miery neznáme.Všeobecne sa uznáva, že mnohé proteíny interagujú s jedným alebo viacerými cytokínmi, aby sa zabezpečila plná aktivita, takže buď ISG interagujú priamo, alebo ich interakcie sú sprostredkované bunkovými proteínmi.Napríklad nedávna fotozosieťovaná proteomická štúdia identifikovala ATPázu VCP/p97 ako hlavného interakčného partnera IFITM3, ktorého inhibícia vedie k defektom v lyzozomálnom triedení, obrate a kotransporte IFITM3 s vírusovými časticami 14 .Pomocou imunoprecipitácie sme identifikovali VAPA, proteín spojený s vezikulami, ako interakčného partnera s IFITM1/2/3, ktorý sprostredkováva dozrievanie vírusov sprostredkované cholesterolom, a to potvrdila ďalšia štúdia s použitím kvasinkového dvojhybridného systému.Vedecká podpora 15 , 16 .
Základným biologickým procesom zapojeným do potlačenia infekcie a malígnej transformácie je prezentácia antigénu, ktorá je sprostredkovaná molekulami hlavného histokompatibilného komplexu (MHC).Peptidy (dlhé 8-12 aminokyselín) zo štiepených, predčasne ukončených alebo nesprávne poskladaných proteínov sú vložené do heterodiméru MHC-I (pozostávajúceho z ťažkých a ľahkých reťazcov MHC-I, nazývaného β-2-mikroglobulín; β2M)17,18.Výsledné stabilné MHC-I triméry sú transportované na bunkový povrch, kde prezentujú intracelulárne peptidy CD8+ T bunkám (cytotoxické T bunky)17.T bunky rozpoznávajú a ničia tieto patogény a bunky nesúce nádorovo špecifický antigén.V dôsledku toho patogény a nádorové bunky často potláčajú proces prezentácie antigénu, aby sa vyhli imunitnému dohľadu.Okrem toho je MHC-I downregulovaný v 40-90% ľudských nádorov a je často spojený s horšou prognózou19.
Gény zapojené do reakcie na patogény sa musia rýchlo prepínať medzi stavom pokoja a stavom aktívnej transkripcie.Preto sa predpokladá, že niekoľko bunkových proteínov sa podieľa na odpovedi na vysoký dopyt po IFN počas krátkych časových období, vrátane remodelácie a modifikácie promótorového chromatínu20,21.Väčšina štúdií sa zamerala na identifikáciu jednotlivých ISG proteínových partnerov v prítomnosti IFN.Niekoľko proteomických a transkriptomických štúdií v modelových bunkových systémoch objasnilo účinok IFN na bunkovú krajinu.Napriek rastúcemu chápaniu dynamiky vyvolanej interferónmi však stále vieme málo o zapojení ISG.Pri zvažovaní zložitosti a časovo závislej dynamiky interferónovej signalizácie vyvstávajú dve otázky: (i) je možné stabilizovať a zachytiť multiproteínové komplexy zapojené do rýchlej signalizácie a (ii) môžu byť tieto interakcie mapované do 3D priestoru?
Na vyriešenie týchto problémov sme implementovali chemické zosieťovanie sprostredkované disukcinimidom suberátom (DSS) spojené s hmotnostnou spektrometriou (CLMS), aby sme študovali sieť interakcie proteínov indukovanú IFNa a jej dynamiku.DSS pridáva kovalentné väzby medzi proximálne zvyšky proteínov a/alebo proteínové komplexy in vivo.Následná MS analýza odhaľuje špecifické sieťovacie miesta, ktoré odrážajú priestorovú blízkosť oblastí v konkrétnom proteíne, nazývané vnútorné väzby alebo podjednotky v proteínových komplexoch, nazývané vzájomné vzťahy.Pomocou tohto prístupu sme identifikovali niekoľko nových proteín-proteínových komplexov, ako aj multiproteínové interakčné siete indukované interferónom.Ďalším testovaním podskupiny týchto nových interakcií demonštrujeme, že H2BFS (FS histónového typu H2B; ďalej len H2B) a MDN1 pôsobia ako väzboví partneri pre HLA-A.
Flo-1 bunky sú jedným z najznámejších in vitro modelov adenokarcinómu pažeráka, pretože napodobňujú kľúčové znaky nádorov pažeráka22,23.Nie všetky nádory sú však imunogénne a na určenie, či bunky Flo-1 reagujú na liečbu interferónom, sme bunky Flo-1 ošetrili 10 ng/ml IFNa počas 72 hodín.Bunky Flo-1 vykazovali skorú indukciu pSTAT1 a IRF1, ktorá sa začala 2 hodiny po liečbe a pokračovala 72 hodín, s časovo závislým poklesom stacionárnych hladín IRF1 (obrázok 1A).Zistilo sa, že ISG (MX1, IFITM1, OAS1/2 a ISG15) sú silne indukované po 6 hodinách, čo napodobňuje klasické reakcie strednej a neskorej fázy na IFNa (obrázok 1A).Tieto údaje spoločne naznačujú, že tento bunkový model možno použiť na štúdium interferónových reakcií.
Diferenciálne proteínové expresné reakcie v Flo-1 bunkách po ošetrení IFNa.(A) Expresia proteínu v bunkách Flo-1 ošetrených 10 ng/ml IFNa počas 2, 6, 24, 48 a 72 hodín sa analyzovala imunoblotom s použitím uvedených protilátok ISG.(B) SDS-PAGE gély extraktov celých buniek zafarbené Coomassie modrou po zosieťovaní s DSS pre uvedené časy a koncentrácie.(C) Reprezentatívny imunoblot skúmaný s protilátkou p53(DO-1) z rovnakých vzoriek na vyhodnotenie stupňa zosieťovania proteínov.
Na zachytenie prostredia interakcie proteínov in situ sme použili DSS, široko používané sieťovacie činidlo vďaka svojej vysokej membránovej permeabilite a relatívne krátkemu reakčnému času.Kratší reakčný čas pomáha predchádzať tvorbe veľkých agregátov zosieťovaných proteínov, čím sa zachováva stabilita sieťovacieho činidla.Aby sme určili optimálnu koncentráciu DSS a zabránili nadmernému zosieťovaniu, najprv sme bunky vystavili 5, 2,5 a 1 mM DSS na 5, 10, 5 a 30 minút a analyzovali sme lyzáty pomocou SDS-PAGE farbenej Coomassie. (údaje nie sú uvedené).Bunkové lyzáty sa zdajú byť vysoko zosieťované pri najnižšej koncentrácii a v najkratšom časovom bode.Preto sa DSS titroval na 1, 0,5 a 0,1 mM počas 5 minút (obrázok 1B).Optimálne zosieťovanie bolo pozorované s 0,5 mM DSS počas 5 minút a tieto podmienky boli zvolené pre bunky ošetrené IFNa.Okrem toho obrázok 1C ukazuje Western blot uskutočnený s použitím protilátky p53 (DO-1) na vyhodnotenie stupňa zosieťovania proteínov.
Flo-1 bunky boli ošetrené 10 ng/ml IFNa počas 24 hodín pred pridaním sieťovacieho činidla.Zosieťované bunky boli následne lyzované dvojkrokovou proteolýzou a proteíny boli spracované pomocou FASP (obr. 2)24,25.Zosieťované tryptické peptidy sa analyzovali hmotnostnou spektrometriou (obr. 2).MS/MS spektrá sa potom priradia k proteínovej sekvencii a kvantifikujú sa pomocou MaxQuant26,27.Zo získaných spektier sa pomocou programu SIM-XL identifikovali zosieťované peptidy a jednotlivé zlúčeniny sa spojili do komplexnej siete pomocou výpočtových softvérových kanálov xQuest28 a SIM-XL29 s otvoreným zdrojom (obr. 2).SIM-XL identifikuje interakcie proteín-proteín, vnútorné reťazce a jednotlivé reťazce v jednoduchých alebo zložitých proteínových zmesiach a poskytuje skripty na vizualizáciu interakcií v proteínových štruktúrach.Okrem toho hodnotí každý krížový odkaz ako ID skóre podľa kvality spektra MS/MS29.Identifikovalo sa niekoľko vysoko spoľahlivých interakcií a komplexov proteín-proteín a ďalej sa skúmal nový súbor interakcií pomocou koimunoprecipitácie a konformačných zmien komplexov pomocou modelovania molekulovej dynamiky (MD) (obr. 2) 30, 31.
Schematický prehľad metódy CLMS.Flo-1 bunky boli ošetrené 10 ng/ml IFNa počas 24 hodín, po čom nasledovalo in situ proteínové zosieťovanie s použitím DSS nasledované lýzou buniek a trypsinizáciou.Zosieťované vzorky sa analyzovali pomocou hmotnostného spektrometra Orbitrap a ďalej sa odoberali vzorky na fragmentáciu peptidových prekurzorov počas LC-MS/MS.Dva spojené peptidy sa identifikovali zo získaných spektier pomocou programu Spectrum Recognition Machine of the Crosslinked Peptides (SIM-XL) a všetky zlúčeniny sa spojili do komplexnej siete pomocou výpočtových potrubí.Odfiltrujte interakcie s nízkou spoľahlivosťou na základe skóre falošne pozitívnych výsledkov (FDR).Niekoľko nových interakcií proteín-proteín s vysokou presnosťou sa ďalej potvrdilo pomocou koimunoprecipitácie a konformačné zmeny v komplexoch sa skúmali pomocou modelovania molekulárnej dynamiky (MD).
Celkom -30 500 a - 28 500 peptidov sa detegovalo pomocou MaxQuant v nestimulovaných a stimulovaných vzorkách IFNa (doplnková tabuľka S1, obr. 3A).Distribúcia dĺžky peptidov v oboch prípadoch ukázala vyšší podiel väčších peptidov, čo naznačuje prítomnosť zosieťovaných peptidov (obr. 3B,C).Okrem toho bol väčší podiel väčších peptidov prítomný v rozmedzí 40–55 vo vzorkách ošetrených IFNα (obr. 3C).Mapovanie proteínov proti intenzite log2 ukázalo, že klasické proteíny stimulované interferónom boli najhojnejšie v porovnaní s neošetrenými vzorkami, vrátane MX1, IFIT1/3, OAS2/3, DDX58 a HLA-F (obrázok 3D).Analýza dráh pre proteíny viac ako trojnásobne obohatené v reakcii na liečbu IFNa pomocou databázy dráh Reactome ukázala, že prezentácia a spracovanie antigénu sprostredkované MHC-I bola najdominantnejšou dráhou (obrázok 3E).V súlade s predchádzajúcimi správami boli medzi aktivovanými dráhami antivírusové reakcie sprostredkované OAS a ISG15, ako aj IFNa / β a cytokínová signalizácia.Okrem toho boli z pôvodne získaných MS/MS spektier pomocou SIM-XL identifikované proteínové krížové väzby špecifické pre lyzín a serín.Nedávna štúdia uviedla 104 ISG zahŕňajúce 20 vírusov z 9 tried vírusov metaanalýzou jednotlivých štúdií nadmernej expresie ISG v 5 typoch buniek9.Aby sme však prekonali výpočtové obmedzenia skríningu veľkých súborov údajov, začali sme s menším súborom údajov, aby sme preskúmali možné interakcie medzi zoznamom génov IRDS, ktoré uvádza Padaria et al., z ktorých väčšina sú ISG.
Identifikácia odlišne exprimovaných zosieťovaných proteínov v reakcii na IFNa (údaje získané z MaxQuant).(A) Vennov diagram predstavujúci počet bežných a exkluzívnych peptidov identifikovaných vo vzorkách Flo-1 ošetrených IFNa14 a neošetrených vzorkách.Distribúcia dĺžky peptidov neošetrených (B) a IFNa ošetrených (C) zosieťovaných vzoriek.(D) Tepelná mapa predstavujúca log2 (intenzita LFQ) medzi neošetrenými a IFNa14 ošetrenými Flo-1 bunkami.Ľavý panel ukazuje proteíny najaktívnejšie aktivované v prítomnosti IFNa.(E) Histogram predstavujúci 20 hlavných ciest obohatenia po liečbe IFNa.Databáza dráhy Reactome analyzovala viac ako štvornásobné zmeny v upregulovaných proteínoch reagujúcich na IFNa.
Stimulácia ISG sprostredkovaná interferónom je dobre zdokumentovaná, ale na molekulárnej úrovni je zle pochopené, ako tieto proteíny kulminujú v širokom rozsahu biologických funkcií.Skúmali sme proteínové interakcie s vysokým stupňom spoľahlivosti medzi známymi ISG.Je zaujímavé, že sme identifikovali sieť zahŕňajúcu proteíny MX1, USP18, ROBO1, OAS3 a STAT1, ktoré tvoria veľký komplex v reakcii na liečbu IFNa (obrázok 4, tabuľka S2) 32, 33, 34.Najdôležitejšie je, že tieto interakcie sa našli vo všetkých triplikátoch ošetrených IFNa a nenašli sa v neošetrených vzorkách, čo naznačuje, že sa vytvorili špecificky ako odpoveď na liečbu IFNa.Je známe, že STAT1 transkripčne reguluje expresiu týchto ISG, ale jeho interakcia s ISG na proteínovej úrovni nebola študovaná.Kryštalická štruktúra STAT1 ukázala, že jeho špirálová doména (CCD) nie je zapojená do interakcie s DNA alebo protomérmi počas tvorby dimérov35.Tieto a-helixy tvoria špirálovitú špirálovitú štruktúru, ktorá poskytuje prevažne hydrofilný povrch pre interakcie35.V našich údajoch CLMS sme pozorovali, že väčšina interakcií so STAT1 sa vyskytla v doméne SH2 predchádzajúcej CCD, doméne linkera alebo C-terminálnom chvoste (zvyšky 700-708) (obrázok 4A).Predchádzajúca štúdia uvádza, že USP18 sa viaže na CCD a DNA-binding doménu (DBD) STAT2 a je rekrutovaný do podjednotky interferónového receptora typu I IFNAR2 na sprostredkovanie inhibície signalizácie interferónu typu I24.Naše údaje tiež ukázali, že katalytická doména USP18 interaguje s STAT1 DBD (obrázok 4A, D), čo naznačuje, že STAT1 aj STAT2 môžu hrať úlohu pri priťahovaní USP18 k IFNAR2.
Sieť proteín-proteín ISG identifikovaná v zosieťovaných bunkách ošetrených IFNa.(A) 2D interakčný graf znázorňujúci interakcie proteín-proteín (vygenerované v programe SIM-XL), pričom čiary predstavujú medzimolekulové interakcie (medzná hodnota zosieťovania nastavená na 3,5).Domény rôznych identít sú označené svojou farbou32: doména MX1, Dynamin_N (73–249), Dynamin_M (259–547) a GED (569–660).Domény OAS3: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872) a OAS1_C (903-108).Doména ROBO1, Ig_3 (67–151), I-množina (170–258), I-množina (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678-758) a fn3 (777-864).Polia STAT1: STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657) a STAT1_TAZ2bind (715–739).(B) Kruhový prehliadač zosieťovaných proteínov (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1 a STAT1) s interakciami a interakciami označenými modrou a červenou farbou.Prah zosieťovania bol stanovený na 3,5.Bodové grafy označujú miesta interakcie STAT1 s MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E) a OAS3 (F), ako aj miesta interakcie K alebo S medzi týmito dvoma peptidmi.Na obrázku je prah skóre krížových väzieb nastavený na 3,0.(G) Rôzne miesta interakcie medzi doménami STAT1 a OAS3 DI superponované na ich proteínových štruktúrach v PyMol (systém molekulovej grafiky PyMOL, verzia 2.0 Schrödinger, LLC.);STAT1 (pdb id: 1bf533) a OAS3 (pdb id: 4s3n34).) program.
U ľudí boli opísané dve izoformy USP18, proteín plnej dĺžky, ktorý sa prevažne nachádza v jadre, a izoforma bez N-koncovej domény, USP18-sf, ktorá je rovnomerne distribuovaná v cytoplazme a jadre36.Okrem toho sa predpokladalo, že N-koniec je neštruktúrovaný a nevyžaduje aktivitu izopeptidázy ani väzbu ISG1537.Väčšina interakcií identifikovaných v našej štúdii sa nachádzala na N-konci proteínu, čo naznačuje, že tieto interakcie zahŕňajú USP18 v plnej dĺžke (obrázok 4A, D), a preto sa pravdepodobne vyskytujú v jadre.Okrem toho naše údaje tiež naznačujú, že N-koniec je špecializovaný na interakcie proteín-proteín.Väzbové miesto IFNAR2 sa nachádza medzi zvyškami 312-368 a najmä žiadny z proteínov v komplexe sa neviaže na túto oblasť (obr. 4A)37,38.Tieto údaje spolu naznačujú, že IFNAR2 väzbovú doménu používa výlučne receptorový proteín.Okrem toho sa zistilo, že iba OAS3 a ROBO1 sú spojené s doménami pred N-koncom a väzbovým miestom IFNAR2 (obrázok 4A).
ROBO1 patrí do imunoglobulínovej (Ig) superrodiny transmembránových signálnych molekúl a pozostáva z piatich Ig domén a troch fibronektínových (Fn) domén v extracelulárnej oblasti.Po týchto extracelulárnych doménach nasleduje membránovo-proximálna oblasť a jedna transmembránová špirála 39. Neštruktúrovaná intracelulárna oblasť sa nachádza na C-konci a obsahuje zachované sekvenčné motívy, ktoré sprostredkovávajú väzbu efektorového proteínu39.Oblasť siahajúca od aminokyselín ~1100 do 1600 je väčšinou neusporiadaná.Zistili sme, že MX1 interaguje s ROBO1 prostredníctvom Ig, Fn a intracelulárnych domén, zatiaľ čo väčšina interakcií so STAT1 sa vyskytuje medzi jeho CCD, linkerovou doménou a C-koncom ROBO1 (obr. 4A,E).Na druhej strane, interakcie s DI, DIII a OAS3 spojovníkovými oblasťami boli distribuované v celom proteíne ROBO1 (obr. 4A).
Rodina proteínov oligoadenylátsyntázy (OAS) prijíma a viaže intracelulárnu dvojvláknovú RNA (dsRNA), podlieha konformačným zmenám a syntetizuje 2',5'-viazané oligoadenyláty (2-5 As)40.Zistilo sa, že spomedzi troch OAS vykazuje OAS3 najvyššiu afinitu k dsRNA a syntetizuje najmenšie množstvo 2-5 As, ktoré môže aktivovať RNázu L a tým obmedziť replikáciu vírusu41.Rodina OAS pozostáva z nukleotidových transferázových domén podobných polymeráze beta (pol-p).Predchádzajúci výskum ukázal, že katalytická aktivita C-terminálnej domény (DIII) je závislá od dsRNA-väzbovej domény (DI), ktorá je potrebná na aktiváciu OAS342.Zistili sme, že domény DI a DII OAS3 interagujú s CCD a malou spojovacou oblasťou medzi SH2 a STAT1 TAD (obrázok 4A, F).Prekrytie rôznych miest zosieťovania na proteínovej štruktúre odhalilo interakciu medzi β-listom a slučkou DBD STAT1 a otvorenou kapsou alebo dutinou tvorenou zvyškami 60–75 v doméne DI OAS3 (obr. 4G).Orientácia proteínov v komplexe tiež ukázala, že žiadna z interakcií s OAS3 nenarušila schopnosť viazať DNA jeho domény DI (obr. S1A).Okrem toho N-terminálna doména GTPázy MX1 značne interaguje s DI a DIII doménami OAS3 (obr. 4A).Pozorovali sme tiež interakciu medzi OAS1 a MX1 vo všetkých troch opakovaniach ošetrených IFNa, kde jedna doména OAS1 (tiež katalyticky aktívna) interagovala so všetkými tromi doménami MX1 (obrázok S2A, B).
MX proteíny sú súčasťou veľkej rodiny dyneínu podobných GTPáz, ktoré obsahujú N-koncovú GTPázovú doménu, ktorá viaže a hydrolyzuje GTP, intermediárnu doménu, ktorá sprostredkováva samozostavenie, a C-koncový leucínový zips, ktorý pôsobí ako GTPáza (LZ ).doména efektorová doména25,43.MX1 sa viaže na podjednotky vírusových polymeráz, aby blokovala transkripciu vírusového génu43.Predtým opísaný kvasinkový dvojhybridný skríning ukázal, že MX1 spojený s PIAS1 inhibuje aktiváciu génu sprostredkovanú STAT1 blokovaním DNA-väzbovej aktivity a má tiež aktivitu ligázy SUMO E344, 45.Tu demonštrujeme, že MX1 sa viaže na STAT1 (obrázok 4C, D), avšak ako táto interakcia ovplyvňuje aktiváciu génu sprostredkovanú STAT1 v reakcii na IFNa si vyžaduje ďalšiu štúdiu.Okrem toho sme tiež zistili, že MX1 interagoval s IFIT3 a DDX60 vo všetkých troch opakovaniach ošetrených IFNa (obr. S2C).
DDX60 je IFN-indukovaná cytoplazmatická helikáza, o ktorej sa už predtým uvádzalo, že hrá úlohu pri degradácii vírusovej RNA46 nezávislej od RIG-I.Interaguje s RIG-I a aktivuje svoju signalizáciu ligandovo špecifickým spôsobom 46. DDX60 pozostáva z helikázovej domény DEXD/H-Box a C-terminálnej helikázovej domény, ktoré viažu vírusovú RNA a DNA47.Väčšina jeho interakcií s MX1 a IFIT3 sa vyskytuje v dlhých N- a C-terminálnych oblastiach bez kanonických domén alebo motívov (obr. S2E, F).MX1 je však tiež spojený s doménou helikázy DEXD/H-Box (obr. S2E).Proteíny z rodiny IFIT majú tandemové kópie výrazného motívu helix-turn-helix nazývaného tetrapeptidové opakovanie (TPR).Zistilo sa, že IFIT3 je pozitívny modulátor signalizácie RIG-I, a teda je súčasťou komplexu MAVS.Celkovo vzaté, naše údaje naznačujú, že IFIT3 a DDX60 interagujú predovšetkým v oblasti medzi TPR 3-6 IFIT3 a môžu hrať úlohu v signalizácii RIG-I/MAVS (obr. S2F).
Vzhľadom na to, že skríning celého proteómu je výpočtovo náročný, potom sme celú ľudskú databázu UniProt skrínovali na prítomnosť jedného z opakovaní ošetrených IFNa.V tejto replike sme našli niekoľko vysoko spoľahlivých interakčných sietí pre HLA-A.Analýza proteínových dráh identifikovaných MS/MS spektrami ukázala, že spracovanie a prezentácia antigénu na báze MHC-I je hlavnou dráhou indukovanou interferónom (obr. 3D).Preto sme sa zamerali na štúdium proteínových interakcií molekúl MHC-I s vysokou mierou spoľahlivosti vo všetkých zosieťovaných vzorkách.HLA pozostáva z domén α1, α2 a α3 a ľahkých reťazcov a mikroglobulín β2 (β2m) je konštantný chaperónový proteín49.Po zostavení v endoplazmatickom retikule je HLA nestabilná v neprítomnosti peptidových ligandov50.Peptid viažuca drážka je tvorená vysoko polymorfnými a neštruktúrovanými doménami a1 a a2 v nepeptidovej forme a relatívne menej polymorfnou doménou a351.V prítomnosti IFNa sme detegovali dva komplexy HLA-A: jeden interaguje s HMGA1 a H2B (obrázok 5, tabuľka S3) a druhý interaguje s MDN1, LRCH4 a H2B (obrázok 6).
IFNa indukuje HLA-A interakčnú sieť s H2B (H2BFS) a HMGA1.(A) 2D graf (vygenerovaný v softvéri SIM-XL) zobrazujúci rôzne typy interakcií v komplexe H2B-HLA-A-HMGA1: prepojenie (modré), prepojenie (červené) a jednoduché prepojenie (čierne)..Domény rôznych identít sú farebne označené32: H2B (histón; 2–102) a MHC-I (MHC_1; 25–203, skupina C1; 210–290 a MHC_I_C; 337–364).Prah zosieťovania bol stanovený na 3,5.Bodové grafy označujú miesta interakcie HLA-A s H2B (B) a HMGA1 (C), ako aj miesta interakcie K alebo S medzi týmito dvoma peptidmi.Na obrázku je prah skóre krížových väzieb nastavený na 3,0.(D) Vzťahy medzi proteínmi znázornenými v štruktúrach proteínov H2B, HLA-A a HMGA1 v programe PyMOL.Tieto štruktúry boli modelované pomocou servera Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) a templátové štruktúry pre proteíny H2B, HLA-A a HMGA1 boli 1kx552, 1kj349 a 2eze55.
IFNa indukuje HLA-A interakčnú sieť s H2B (H2BFS), MDN1 a LRCH4.(A) Intramolekulárne (červené) a intermolekulárne (modré) priečne väzby prezentované na 2D interaktívnej mape (vygenerovanej v softvéri SIM-XL) s MDN1 znázorneným ako kruh.Prah zosieťovania bol stanovený na 3,5.Domény rôznych identít sú farebne označené32: H2B (histón; 2–102), MHC-I (MHC_1; 25–203, skupina C1; 210–290 a MHC_I_C; 337–364) a LRCH4 (LRR_8 (68–126), LRR_8 (137 – 194) a CH (535 – 641)).(B) Vzťahy medzi proteínmi znázornenými v štruktúrach proteínov H2B, HLA-A, LRCH4 a MDN1 v programe PyMOL.Tieto štruktúry boli modelované pomocou servera Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) s templátovými štruktúrami 1kx552, 1kj349, 6hlu62 a 6i2665 pre proteíny H2B, HLA-A, LRCH4 a MDN1, resp.Bodové grafy zobrazujúce miesta interakcie K alebo S pre HLA-A s H2B (C), LRCH4 (D) a MDN1 (E).Pre grafy bol prah skóre krížovej väzby nastavený na 3,0.
Okrem zachovania integrity genómu sa histón H2B podieľa aj na regulácii transkripcie.Proteín H2B pozostáva z centrálnej histónovej domény (HFD) tvorenej tromi a-helixami oddelenými slučkami a C-koncovým koncom 41,52.Väčšina interakcie s H2B sa vyskytuje v α1 špirále, ktorá poskytuje trimerizáciu s HFD heterodimérom (obr. 5A,B).Hoci sa lyzíny podieľajú na väzbe DNA, niektoré lyzíny sú tiež alternatívnymi miestami acetylácie alebo metylácie.Napríklad zvyšky K43, K46 a K57 z H2B nie sú zapojené do priamej väzby DNA, ale sú cieľmi rôznych post-transkripčných modifikácií53.Podobne zvyšky K44, K47 a K57 v H2B môžu hrať alternatívnu úlohu v prítomnosti IFNa, vrátane interakcií s inými proteínmi (obr. 5A, B).Okrem toho extrachromozomálny histón H2B aktivuje imunitnú odpoveď v rôznych typoch buniek, pričom pôsobí ako cytosolický senzor na detekciu fragmentov dvojvláknovej DNA (dsDNA) odvodených z infekčných agens alebo poškodených buniek54.V prítomnosti DNA vírusov deplécia H2B inhibovala produkciu IFN-β a fosforyláciu STAT154.Je tiež známe, že H2B sa pohybuje dovnútra a von z jadra rýchlejšie ako iné jadrové históny54.Vo vybraných neošetrených vzorkách boli tiež pozorované interakcie H2B s MDN1 a LRCH4.Zistili sme, že HLA-A interagovala s H2B vo všetkých troch vzorkách ošetrených IFNa a v jednej neošetrenej opakovanej vzorke.Tieto údaje odrážajú úlohu H2B v alternatívnej fyziologickej funkcii nezávislej od transkripčnej regulácie.
HMGA1 (skupina s vysokou mobilitou AT-Hook 1), malý nukleoproteín bohatý na aminokyseliny podporujúce ochorenie, bol identifikovaný v spojení s HLA-A.Má kyslý C-koncový chvost a tri odlišné DBD nazývané AT háčiky, pretože sa viažu na malú drážku oblasti bohatej na AT v dsDNA55,56.Táto väzba spôsobuje, že sa DNA ohýba alebo narovnáva, čo umožňuje kanonickým transkripčným faktorom prístup k ich konsenzuálnej sekvencii.Predpokladá sa, že C-koncový koniec je zapojený do interakcií proteín-proteín a náboru transkripčných faktorov, pretože mutanty s C-koncovou deléciou nie sú schopné iniciovať transkripciu57.Okrem toho táto doména obsahuje niekoľko konzervovaných fosforylačných miest, ktoré sú známymi substrátmi pre kinázy58.Pozorovali sme interakcie HLA-A a H2B s HMGA1 mimo C-terminálnej domény, čo naznačuje, že C-terminálna doména sa používa hlavne na väzbu transkripčného faktora (obr. 5A, C).Proteíny HMGA súťažia s histónom H1 o väzbu na adaptorovú DNA, čím sa zvyšuje dostupnosť57.Podobne sa zdá pravdepodobné, že HMGA interaguje s histónom H2B pozdĺž spojovacej DNA v konkurencii s histónom H1.HMGB1 indukuje expresiu HLA-A, -B a -C v dendritických bunkách, čo vedie k ich aktivácii59, ale interakcia medzi HMG a HLA nebola predtým hlásená.Zistili sme, že HMGA1 interaguje s doménami a1 a a3 HLA-A, pričom väčšina interakcií je mimo jeho 3 DBD (obrázok 5A,C).V našich rukách sa zistilo, že HLA-A je lokalizovaný v jadre (údaje nie sú uvedené) a vzhľadom na to, že H2B a HMGA1 sú tiež prítomné v jadre, táto interakcia sa pravdepodobne vyskytuje v jadre.Špecifické adukty merané medzi H2B, HLA-A a HMGA1 sú znázornené na obrázku 5D.
Väčšina interakcií HLA-A s inými proteínmi sa vyskytuje v rámci jeho al a α2 domén a neusporiadanej C-terminálnej domény (obr. 6).V jednom z týchto príkladov sme zistili, že HLA-A interaguje s neusporiadaným N-koncovým chvostom LRCH4 (obrázok 6A, D).LRCH4 reguluje aktiváciu TLR4 a indukciu cytokínov LPS, čím moduluje vrodenú imunitnú odpoveď60,61.Je to membránový proteín s deviatimi opakovaniami bohatými na leucín (LRR) a homológnym motívom kalmodulínu (CH) v jeho ektodoméne, po ktorom nasleduje transmembránová doména (TMD)60,62.Bolo hlásené, že CH domény sprostredkovávajú interakcie proteín-proteín60.Úsek približne 300 aminokyselín medzi doménami LRR a CH je relatívne dostupný, ale neusporiadaný.Na základe funkcie neusporiadaných oblastí ako mediátorov proteín-proteínových sietí a vezikulárneho transportu 63 sme zistili, že väčšina proteínových interakcií sa vyskytuje v neusporiadaných oblastiach.Interakcie s MDN1 boli distribuované po celej dĺžke proteínu, vrátane LRR1, LRR6, CH domén a náhodných oblastí, zatiaľ čo H2B sa viazal hlavne na CH doménu (obr. 6A, B).Je pozoruhodné, že žiadna z interakcií nezahŕňala TMJ, čo naznačuje špecifickosť prístupu CLMS (obrázok 6A, B).
MDN1 bol tiež identifikovaný ako súčasť proteínovej siete HLA-A (obrázok 6A).Patrí do rodiny proteínov AAA (ATPázy spojené s rôznymi aktivitami).Toto je rovnaká N-terminálna doména AAA, ktorá sa organizuje do hexamérneho kruhu a odstraňuje montážny faktor z ribozomálnej podjednotky 60S 64.sa zdá byť podobný dyneínu64,65,66.Okrem toho za oblasťou bohatou na Asp/Glu nasleduje doména MIDAS (miesto závislé od kovových iónov).Vzhľadom na veľkú veľkosť MDN1 (približne 5600 aminokyselín) a jeho obmedzenú homológiu s dobre študovanými proteínmi je o jeho štruktúre a funkcii u ľudí málo známe.Identifikovali sme HLA-A, H2B a LRCH4 ako väzbových partnerov MDN1 a odhalili sme ich orientáciu ako proteínové komplexy v PyMol (obr. 6A,B).Tieto tri proteíny interagujú s doménou AAA, linkerovou doménou podobnou dyneínu a možno s doménou MIDAS MDN1.V predchádzajúcej správe afinitná purifikácia návnadových proteínov identifikovala MDN1 ako proteín spojený s histónom H2B67.Okrem toho nedávna štúdia tiež uviedla interakciu medzi MDN a HLA-B v bunkách HCT116 pomocou afinitne purifikovanej hmotnostnej spektrometrie, čo podporuje naše zistenia68.Identifikácia tohto komplexu vo vzorkách ošetrených IFNa naznačuje úlohu MDN1 v interferónovej signalizácii.
Pretože gény HLA sú vysoko polymorfné, extrahovali sme sekvenčné čítania mapujúce HLA-A, -B a -C z údajov sekvenovania RNA buniek Flo-1 (údaje nie sú uvedené).Peptidové sekvencie konzistentné so sekvenčným čítaním odhalili významné rozdiely medzi HLA-A, -B a -C v oblastiach, kde sa v HLA-A nachádzali zosieťované peptidy (obrázok S3).Okrem toho sme nepozorovali zosieťovanie proteín-proteín molekúl HLA-B/C s proteínmi H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4.To naznačuje, že proteínová interakcia nájdená medzi HLA-A, MDN1, LRCH1 a HMGA1 je HLA-A špecifická.Okrem toho proteomická analýza nezosieťovaných vzoriek (tabuľka S4) ukázala, že HLA-A má vyššie pokrytie sekvencie v porovnaní s HLA-B alebo HLA-C.Peptidy identifikované pre HLA-A mali vysokú intenzitu vo vzorkách ošetrených IFNa aj neošetrených vzorkách.
Aby sme zabezpečili, že tu identifikované interakcie neboli spôsobené nešpecifickým zosieťovaním dvoch proteínov v tesnej priestorovej blízkosti, ďalej sme potvrdili dva nové faktory interagujúce s HLA-A vykonaním koimunoprecipitačných testov.Interakcie HLA-A s endogénnym MDN1 a H2B boli detegované v bunkách Flo-1 ošetrených aj neošetrenými IFNa (obrázok 7, obrázok S4).Potvrdili sme, že HLA-A bol zachytený H2B v imunoprecipitátoch a že táto asociácia bola spôsobená liečbou IFNa, pretože HLA-A chýbala vo vzorkách imunoprecipitátov z neošetrených buniek (obrázok 7A).Naše údaje však naznačujú, že IFNa odlišne reguluje väzbu HLA-A na H2B a MDN1.IFNa indukuje asociáciu medzi H2B a HLA-A, ale znižuje jej asociáciu s MDN1.Zistili sme, že MDN1 bol spojený s HLA-A v kontrolách a pridanie IFNa znížilo túto interakciu nezávisle od indukcie MDN1 prostredníctvom IFNa (obrázok 7B, C).Okrem toho imunoprecipitácia HLA-A zachytila ​​H2B v bunkách A549 (obr. S4), čo naznačuje, že táto interakcia je nezávislá od typu bunky.Celkovo tieto výsledky podporujú interakcie HLA-A s H2B a MDN1 sprostredkované interferónom.
HLA-A súčasne čistí H2B a MDN1.Reprezentatívne endogénne imunobloty H2B (A) a MDN1 (B) sa imunoprecipitovali z buniek Flo-1 ošetrených IFNa a testovali sa na uvedené protilátky.Ako negatívna kontrola sa použili myšie a králičie IgG.(C) Relatívne množstvá (vstup) rôznych antigénov sú znázornené imunoblotmi testovanými proti uvedeným protilátkam, ako kontrola nanášania sa použil p-aktín.
Skúmali sa štrukturálne vlastnosti jednej z interferónom indukovaných vysoko spoľahlivých zosieťovaných sietí, H2B-HLA-A-HMGA1.Použili sme modelovanie molekulárnej dynamiky ako alternatívny prístup na pochopenie konformačnej dynamiky proteínov zapojených do tohto komplexu (obrázok 8).Závery z údajov CLMS naznačujú možnosť rôznych konformácií proteínov H2B, HLA-A a HMGA1.Preto boli v rozpúšťacom médiu modelované nasledujúce potenciálne komplexy: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A a H2B-HLA-A-HMGA1.Počiatočný skríning proteín-proteín pomocou balíka MOE (Molecular Operating Environment; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Kanada) navrhol možné konformácie, ktoré sa medzi týmito proteínmi líšia (obr. 8A).Vizualizácia dokovacieho proteínového komplexu odhalila niekoľko interakcií a možných konformácií (obrázok 5A, 8).Jedna možná konformácia je teda znázornená na obrázku 8A (s označenými krížovými väzbami) a bola ďalej hodnotená pomocou modelovacieho potrubia MD.Okrem toho väzba H2B alebo HMGA1 na HLA-A zvýrazňuje vyššiu afinitu H2B k HLA-A (obr. 8A).
Konformačná dynamika možných sietí medzi komplexmi H2B (H2BFS)-HLA-A, HMGA1-HLA-A a H2B-HLA-A-HMGA1.(A) Ľavý panel je 2D mapa (vygenerovaná v softvéri SIM-XL) intramolekulárnych (červená) a intermolekulárnych (modrá) priečnych väzieb (medzná hodnota priečnej väzby nastavená na 3,5).Okrem toho sú identifikované zosieťovacie zvyšky označené na štruktúrach proteínov H2B, HLA-A a HMGA1.Pridružené konformácie týchto proteínov boli extrahované pomocou dokovacieho potrubia implementovaného v balíku MOE.Ľavý dolný panel ukazuje rôzne možné konformácie komplexov H2B-HLA-A a HMGA1-HLA-A s rôznymi väzbovými afinitami proteín-proteín (GBVI/WSA dG; kcal/mol).(B) Štandardná odchýlka (RMSD) atómových pozícií (okrem atómov vodíka) pre každú proteínovú štruktúru.(C) Intermolekulové interakcie proteín-proteín vodíkových väzieb z rôznych simulovaných komplexov s ohľadom na špecifické interakcie s trvaním ≥ 10 ns.Medzná vzdialenosť donor-akceptor h-väzba bola nastavená na 3,5 Á a medzný uhol donor-H-akceptor bol nastavený na ≥ 160°–180°.(D) Označené zvyšky tvoriace interakcie proteín-proteín HLA-A s ich príslušnými partnermi, v rozsahu ≥ 20 ns, extrahované z falošných komplexov HLA-A-H2B a HLA-A-HMGA1.Proteínové štruktúry predstavujú priemernú štruktúru 100 ns MDS.(E) Interakcie medzi komplexmi HLA-A-H2B a HLA-A-HMGA1 v porovnaní s interakciami sledovanými simuláciou H2B-HLA počas 100 ns na základe miesta interakcie K alebo S medzi týmito dvoma peptidmi.Komplexy /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.Prahová hodnota pre hodnotenie krížových väzieb bola nastavená na 3,0 a do úvahy sa brali špecifické interakcie z MDS s ≥ 10 ns.Proteínové štruktúry boli vizualizované pomocou balíkov BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, USA) a Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Kanada).
Stabilita molekúl HLA-A v priebehu času (štandardná odchýlka; RMSD alebo štandardná odchýlka; RMSF) ukázala, že prítomnosť proteínov H2B alebo HMGA1 v komplexoch stabilizovala HLA-A (obrázok 8B, obrázok S5).Proteín HMGA1 sa pevne viaže na B2M miesto HLA-A, čím indukuje stabilitu HLA-A aminokyselín v komplexe HLA-A-HMGA1 alebo H2B-HLA-A-HMGA1 (obrázok 8B, obrázok S5).najmä sa zistilo, že HLA zvyšky -60-90 a -180-210 sú menej flexibilné v prítomnosti H2B (obr. 8B).H2B a HMGA1 vykazovali lepšiu väzbu na HLA-A v komplexe H2B-HLA-A-HMGA1 v porovnaní s väzbou HLA-A na samotný H2B alebo HMGA1 (obrázok 8C, D; tabuľka S5).Zvyšky zapojené do vodíkových väzieb (vysoká obsadenosť modelovaná MD ≥ 10 ns) sa zhodujú s miestami interakcie CLMS (zvyšky K alebo S) v komplexe, čo naznačuje, že interakcie identifikované pomocou CLMS sú veľmi spoľahlivé.Spoľahlivosť (obr. 8E).Pri modelovaní CLMS a MD sa zistilo, že HLA-A zvyšky medzi približne 190-210 a približne 200-220 aminokyselinami viažu H2B, respektíve HMGA1 (OBR. 8E).
Interakcie proteín-proteín tvoria dynamické štrukturálne siete, ktoré sprostredkúvajú intracelulárnu komunikáciu v reakcii na určité stimuly.Pretože mnohé proteomické prístupy detegujú zmeny v celkovom ustálenom stave proteínu, dynamika interakcie proteín-proteín vyžaduje ďalšie nástroje na zachytenie väzbových rozhraní a CLMS je jedným z takýchto nástrojov.Interferónový signalizačný systém je cytokínová sieť, ktorá umožňuje bunkám reagovať na celý rad environmentálnych patogénnych a vnútorných patologických signálov, ktoré kulminujú indukciou podskupín interferónom indukovateľných proteínov.Použili sme CLMS, aby sme určili, či je možné identifikovať nové interakcie proteín-proteín medzi panelom proteínov indukovaných interferónom.Na zachytenie proteínových komplexov sa použila globálna analýza zosieťovania proteínov v modeli buniek Flo-1 citlivom na interferón.Extrakcia tryptických peptidov z nezosieťovaných a zosieťovaných buniek umožňuje počítanie peptidov, obohatenie dráhy a distribúciu dĺžky peptidu s definovanou intenzitou LFQ.Kanonické proteíny indukovateľné interferónom boli identifikované ako pozitívna interná kontrola, zatiaľ čo boli pozorované nové intermolekulárne a intramolekulárne zosieťované adukty kanonických proteínov indukovateľných interferónom, ako sú MX1, UP18, OAS3 a STAT1.Boli skúmané rôzne štrukturálne vlastnosti a interakcie vo funkčných oblastiach.
Interakcia medzi HLA-A, MDN1 a H2B sa detegovala imunoblotovaním v bunkách Flo-1 a A549 ošetrených a neošetrených IFNa.Naše výsledky zdôrazňujú, že HLA-A komplexuje s H2B spôsobom závislým od IFNa.Naša práca predstavuje zaujímavú cestu pre ďalšie skúmanie spoločnej lokalizácie týchto dvoch komplexov.Bolo by tiež zaujímavé rozšíriť prístup CLMS na panel bunkových línií, aby sa identifikovali interferónom sprostredkované proteínové interakcie nezávislé od bunkového typu.Nakoniec sme použili modelovanie MD ako alternatívny prístup na pochopenie konformačnej dynamiky proteínov zapojených do komplexu H2BFS-HLA-A-HMGA1, ktorý sledoval intramolekulárne a intermolekulárne krížové rozhovory.Závery z údajov CLMS naznačujú možnosť rôznych konformácií proteínov H2BFS, HLA-A a HMGA1.Možné rôzne konformácie medzi týmito dokovacími proteínovými komplexmi odhalili niekoľko interakcií podobných interakciám pozorovaným v súbore údajov CLMS.Jednou z hlavných silných stránok našej metódy je, že umožňuje ľahkú identifikáciu interagujúcich vysoko polymorfných génov, ako je HLA, takže bude zaujímavé študovať interakcie proteínov špecifických pre HLA haplotyp, ktoré sa inak ťažko študujú.Celkovo naše údaje ukazujú, že CLMS možno použiť na rozšírenie nášho chápania signálnych sietí indukovaných interferónom a poskytnúť základ pre štúdium zložitejších medzibunkových systémov v mikroprostredí nádoru.
Flo-1 bunky boli získané z ATCC a udržiavané v DMEM (Gibco) doplnenom 1 % penicilínom/streptomycínom (Invitrogen), 10 % fetálnym hovädzím sérom (Gibco) a skladované pri 37 °C a 5 % C02.Inkubácia.Bunky boli pestované do 70-80% konfluencie pred ošetrením IFNa14 (vyrobené Edinburgh Protein Production Facility).Všetky ostatné chemikálie a činidlá boli zakúpené od Sigma Aldrich, pokiaľ nie je uvedené inak.
Flo-1 bunky boli kultivované v 6-jamkových doštičkách a nasledujúci deň boli bunky ošetrené 10 ng/ml IFNa14 počas 24 hodín do približne 80% konfluencie.Bunky boli trikrát premyté PBS a ligované s čerstvo pripraveným DSS (Thermo Fisher Scientific) (rozpusteným v DMSO) v PBS počas 5 minút pri 37 °C do konečnej koncentrácie 0,5 mM.DSS sieťovacia reakcia bola nahradená PBS a zvyškový DSS bol zastavený pridaním 20 mM Tris (pH 8,0) v PBS počas 15 minút pri 37 °C.Bunky sa zozbierali zoškrabaním a zozbierali sa do skúmaviek s nízkou väzbou (Axygen).
Bunková peleta sa lýzovala s 300 ul močovinového lyzačného pufra (8 M močovina, 0,1 M Tris, pH 8,5) počas 30 minút pri teplote miestnosti s občasným pretrepávaním.Všetky kroky odstreďovania sa uskutočňovali pri 14 000 xg pri 8 °C.Lyzát centrifugujte 10 minút a preneste supernatant do novej skúmavky.Zostávajúce číre častice sa rozpustili v 150 ul druhého lyzačného pufra (2 M močovina, 2 % (hmotn./obj.) SDS (dodecylsulfát sodný)) počas 30 minút alebo dlhšie, kým sa nezískal homogénny vodný roztok.Lyzát sa odstreďoval 20 minút a supernatant sa zmiešal s lyzátom získaným v predchádzajúcom kroku.Koncentrácie proteínov sa hodnotili pomocou testu Micro BCA (Thermo Fisher Scientific) podľa pokynov výrobcu pre postupy na mikrodoštičkách.Vzorky boli rýchlo zmrazené v tekutom dusíku a skladované pri -80 °C.
Približne 100 ug rozpustného zosieťovaného proteínu sa spracovalo s použitím modifikovaného protokolu prípravy filtračnej vzorky (FASP), ako je opísané v Wisniewski et al.69 Stručne, proteín sa zosieťuje s 200 ul močovinového pufra (8 M močovina v 0,1 M Tris, pH 8,5), premieša sa a rozdelí na polovicu.Všetky kroky odstreďovania sa uskutočňovali pri 14 000 xg pri 25 °C.Prvá polovica zosieťovaného proteínového lyzátu sa preniesla do 10 kDa odstredivého filtračného zariadenia Microcon vybaveného membránou Ultracel-10 (Merck), po čom nasledovala centrifugácia na filtri počas 25 minút.Potom pridajte druhú polovicu proteínu do filtra a opakujte rovnaké kroky.Izolácia proteínu sa uskutočnila pridaním 100 ul 17 mM tris(2-karboxyetyl)fosfín hydrochloridu (TCEP) v močovinovom pufri.Regenerácia sa miešala v termomixéri pri 600 ot./min. počas 30 minút pri 37 °C.Okrem toho sa kolóna odstredila a redukovaný zosieťovaný proteín sa alkyloval použitím 100 ul 50 mM jódacetamidu v močovinovom pufri.Alkylačná reakcia sa uskutočnila pri teplote miestnosti počas 20 minút v tme.Otočte kolónu, premyte steny kolóny 3-krát 100 µl močovinového pufra a potom odstreďte.Rovnaká operácia sa uskutočnila 3-krát s použitím 100 ul 100 mM hydrogenuhličitanu amónneho.Pred trypsinizáciou vymeňte odberovú skúmavku za novú.Pridajte štiepiaci pufor obsahujúci 50 mM hydrogénuhličitanu amónneho a 1 ul trypsínu zriedeného v trypsínovom pufri (Promega).Pomer trypsínu k proteínu sa udržiaval na približne 1:33 a digesčné reakcie sa inkubovali cez noc pri 37 °C vo vlhkej komore.Zosieťovaný peptid sa eluoval z filtra centrifugáciou počas 25 minút.Výťažnosť peptidu sa zlepšila pridaním 50 ul 0,5 M NaCl do filtra, po čom nasledovala centrifugácia počas 25 minút.
C18 Micro Spin kolóny (Harvard Apparatus) sa použili na odsolenie zosieťovaných tryptických peptidov podľa protokolu opísaného Bouchalom a kol. 70 s malými modifikáciami.Stručne, C18 spinové kolóny sa aktivovali tromi premytiami 0,1 % kyseliny mravčej (FA) v acetonitrile (AcN) (Merck) a dvoma premytiami 0,1 % FA.Kolóna sa hydratovala 0,1 % FA počas 15 minút.Vzorky sa naložia do rotačných kolón a premyjú sa 3-krát 0,1 % FA.Odsolené peptidy sa postupne eluovali s postupným gradientom s použitím 50 %, 80 % a 100 % AcN v 0,1 % FA.Vzorky sa sušili v koncentrátore SpeedVac Plus (Eppendorf), kým zvyšková kvapalina úplne nezmizla.Eluované peptidy sa rozpustili v 100 ul 0,08 % kyseliny trifluóroctovej v 2,5 % AcN a koncentrácie sa merali na NanoDrop 2000 (Thermo Scientific).Približne 1 ug zosieťovaného peptidu na vzorku sa vstrekol do systému LC-MS/MS.
Zosieťované peptidy boli separované na systéme UltiMate 3000 RSLCnano LC (Thermo Scientific) pripojenom k ​​hmotnostnému spektrometru Orbitrap Exploris 480 (Thermo Scientific).Zosieťované peptidy sa zhromaždili na 300 um ID, 5 mm dlhej u-predkolóne C18 zachytávacej kolóne naplnenej C18 PepMap100 sorbentom a 5 um PepMap sorbentom (Thermo Scientific).Naplňte prietokovú sadu pumpy pri 5 ul/min 0,08 % kyseliny trifluóroctovej rozpustenej v 2,5 % AcN.Zosieťované peptidy boli separované na analytickej kolóne z taveného oxidu kremičitého s vnútorným priemerom 75 μm a dĺžkou 150 mm, naplnenej 2 μm sorbentom PepMap (Thermo Scientific).Mobilné fázy A a B pozostávali z 0,1 % FA vo vode a 0,1 % FA v acetonitrile.Gradient začína na 2,5 % B a zvyšuje sa lineárne na 40 % B počas 90 minút, potom na 90 % B počas nasledujúcich 2 minút.Zloženie mobilnej fázy sa udržiavalo na 90 % B počas 10 minút a potom sa lineárne znižovalo na 2,5 % B počas 2 minút.Kolóna bola ekvilibrovaná pri 2,5 % B počas 8 minút pred ďalším cyklom.Zosieťované peptidy eluované z analytickej kolóny boli ionizované v zdroji nanoelektrosprejovej ionizácie (NSI) a vstreknuté do hmotnostného spektrometra Exploris 480 (Thermo Scientific).
Hmotnostný spektrometer Orbitrap Exploris 480 pracoval v režime pozitívnej korelácie údajov.Úplné skenovanie bolo vykonané v reze v rozlíšení 120 000 s rozsahom nastavenia od m/z 350 Th do m/z 2000 Th.Normalizovaný cieľ AGC bol nastavený na 300 % s maximálnym vstupným časom 50 ms.Monoizotopová detekcia píkov bola zavedená pre peptidy.Parameter uvoľnenia obmedzení sa nastaví na hodnotu true, ak sa nájde príliš málo prekurzorov.Minimálna iónová sila prekurzora bola nastavená na 5,0e3 a do experimentov boli zahrnuté stavy nabitia prekurzora až do +8.
Čas cyklu medzi hlavnými skenmi v režime korelácie údajov bol nastavený na 2,5 sekundy.Vylúčenie dynamickej hmoty bolo nastavené na 20 s po prvej fragmentácii prekurzorového iónu.Okno na izoláciu prekurzora bolo nastavené na 2 Th.Typ normalizovanej kolíznej energie s pevným režimom kolíznej energie bol zvolený v dátovo závislom MS/MS skene.Energia kolízie nastavená na 30 %.Rozlíšenie Orbitrapu bolo nastavené na 15 000 a cieľ AGC na 100 %.Vlastný maximálny čas vstrekovania je nastavený na 60 milisekúnd.
Pred sledovaním siete proteín-proteín v zosieťovaných vzorkách sme nespracované súbory spracovali pomocou balíka MaxQuant (verzia 1.6.12.0)26,27 na identifikáciu sledovateľných peptidov/proteínov vo vzorkách.Okrem toho sa podobné proteomické analýzy uskutočnili na nezosieťovaných vzorkách Flo-1 ošetrených a neošetrených IFNa.Údaje o MS/MS boli vyhľadávané v ľudskej databáze UniProt (www.uniprot.org) (nahraté 12. augusta 2020, obsahuje 75 093 záznamov) pomocou vstavaného vyhľadávacieho nástroja Andromeda27.Vyhľadávanie sa uskutočnilo bez uvedenia špecifickosti enzýmu a rôznych modifikácií deamidácie (N, Q) a oxidácie (M).Tolerancie hmotnosti prekurzora boli nastavené na 20 ppm a produktové ióny na 0,02 Da.Počiatočná a maximálna odchýlka hmotnosti bola nastavená na 10 ppm.Maximálna hmotnosť peptidu bola nastavená na 4600 Da a sekvenčná podobnosť bola nastavená medzi 7 a 25 aminokyselinami (aa).Ďalšia štatistická analýza sa uskutočnila pomocou programu Perseus (verzia 1.6.10.45).Obsah proteínu sa vypočítal normalizáciou spektrálnej intenzity proteínu (intenzita LFQ; neznačená kvantifikácia)27 a hodnoty intenzity sa previedli na Log2.Hierarchické zoskupenie proteínov identifikovaných ich peptidovou intenzitou sa vytvorilo pomocou balíka pheatmap (v1.0.12) v R (v 4.1.2).Analýza obohatenia dráhy sa uskutočnila s použitím databázy dráh Reactome pre proteíny ošetrené IFNa, ktoré boli viac ako štyrikrát aktivované v porovnaní s neošetrenými vzorkami.
Identifikácia lyzínových (K) alebo serínových (S) špecifických chemických krížových väzieb proteínových komplexov monitorovaných pomocou LC-MS/MS sa uskutočnila pomocou spektroskopického identifikačného zariadenia (SIM-XL) pre zosieťované peptidy (SIM-XL)29.Najprv sa skúmali možné interakcie medzi génmi podpisu odolnosti voči poškodeniu DNA (IRDS) spojenými s interferónom (IFN) s použitím súboru údajov o proteíne IRDS opísaného v Padariya et al.28.Skríning všetkých stavov a opakovaní celého ľudského UniProt je výpočtovo náročný, takže celá databáza ľudského UniProt (www.uniprot.org) (stiahnutá 12. augusta 2020 obsahuje 75 093 záznamov) oproti opakovaniam ošetreným IFNα.Jeden z filtrov pre interakcie s vysokou dôveryhodnosťou.Tieto získané vysoko významné interakcie boli rozšírené a testované vo všetkých opakovaniach a podmienkach.
V SIM-XL sa pre zosieťovacie činidlo (XL) použil DSS a posun hmotnosti XL a posun hmotnosti modifikácie boli nastavené na 138,06 a 156,07.Do úvahy prichádzajú nasledujúce sieťovacie reakčné miesta: KK, KS a KN-TERM, bez reportérových iónov.Prekurzor aj fragment ppm boli nastavené na 20 a prah Xrea bol nastavený na 0,15.Trypsín bol považovaný za úplne špecifický a bola implementovaná metóda fragmentácie vysokoenergetickej C-pasce (HCD).XCorr dynamická redukcia DB a minimálny počet peptidov pre dynamickú redukciu DB boli nastavené na 2,5 a 2, v tomto poradí.Ďalšími parametrami sú: pravdepodobnosť monoizotopu a limit koincidencie vrcholu, minimálne 4 zvyšky AA na vlákno a maximálny náboj vlákna a 3 maximá vynechaných delení.Výsledné zošité 2D mapy sa analyzovali v (SIM-XL) a na zostavenie 2D máp sa použilo grafické znázornenie xQuest28.Proteínové krížové väzby na proteínových štruktúrach sú poskytnuté v PyMol (PyMOL Molecular Graphics System, verzia 2.0 Schrödinger, LLC).
Štruktúry proteínového modelu boli vytvorené pomocou servera Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 s použitím princípov modelovania homológie a implementácie „Skrytej Markovovej metódy“.Phyre2 generuje modelové štruktúry založené na zoradení sekvencií so známymi proteínovými štruktúrami.Pre proteíny H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4 a MDN1 sa použili templátové štruktúry 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62 a 6i2665.Okrem toho sa zvažovala aj štruktúra AlphaFold71 MX1, UBP18 a ROBO1.Proteínová štruktúra bola vizualizovaná pomocou balíka BIOVIA Discovery Studio Visualizer (Dassault Systèmes, BIOVIA, San Diego, CA, USA) a balíka Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Kanada).