ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Duplexná zváraná rúrka pre chemický komponent v chemickom priemysle, Nedostatok SPECC1L vedie k zvýšenej stabilite spojených spojov a zníženiu vypadávania buniek lebečnej neurálnej lišty.

Ďakujeme, že ste navštívili Nature.com.Používate verziu prehliadača s obmedzenou podporou CSS.Pre najlepší zážitok vám odporúčame použiť aktualizovaný prehliadač (alebo vypnúť režim kompatibility v programe Internet Explorer).Okrem toho, aby sme zabezpečili nepretržitú podporu, zobrazujeme stránku bez štýlov a JavaScriptu.

ASTM A790 2507 / 2205 1,4462 / 1,4410 Duplexná zváraná rúra pre chemický priemysel

Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.je popredný výrobca , ktorý sa špecializuje na bezšvíkové rúry z nehrdzavejúcej ocele , svetlo žíhané rúry , bezšvíkové vinuté rúry atď .Aby sme uľahčili zákazníkom, zvárame aj rúry a rúry.Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.má najmodernejšie výrobné a testovacie zariadenia.Môžeme úplne uspokojiť vašu požiadavku.Podľa normy veľmi prísne, nami vyrábané rúry majú vždy správnu toleranciu OD a WT.Kontrola tolerancie je prísne v súlade s výrobnými normami.Naše výrobky sú vždy spokojní so zákazníkmi.Zákazníci, ktorí si kúpili naše produkty, vytvorili viac ziskov.
a) OD (vonkajší priemer): 3,18 mm až 101,6 mm
b) WT (hrúbka steny): 0,5 mm až 20 mm
c) Dĺžka: Podľa požiadaviek zákazníka
d) Normy: ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 atď
e) Procesná metóda: ERW, EFW atď

Posúvače zobrazujúce tri články na snímke.Na posúvanie medzi snímkami použite tlačidlá späť a ďalej, na posúvanie sa po jednotlivých snímkach použite tlačidlá ovládača posúvania na konci.
Bunky lebečného neurálneho hrebeňa (CNCC) sa odlupujú z embryonálnych nervových záhybov a migrujú do hltanových oblúkov, ktoré tvoria väčšinu štruktúr strednej časti tváre.Dysfunkcia CNCC hrá dôležitú úlohu v etiológii orofaciálneho rázštepu, bežnej vrodenej malformácie.U pacientov s atypickými a syndromickými rázštepmi boli nájdené heterozygotné mutácie SPECC1L.Tu uvádzame zvýšené farbenie komponentov kanonického adhezívneho spojenia (AJ), β-katenínu a E-kadherínu v kultivovaných knockdown bunkách SPECC1L a elektrónové mikrofotografie ukazujú apikálno-bazálnu difúziu AJ.Aby sme pochopili úlohu SPECC1L v kraniofaciálnej morfogenéze, vytvorili sme myšací model s deficitom Specc1l.Homozygotné mutanty sú embryonálne letálne a vykazujú zhoršené uzatvorenie neurálnej trubice a CNCC lamináciu.Farbenie proteínu AJ je zvýšené v mutantných nervových záhyboch.Tento defekt AJ je v súlade s defektom v delaminácii CNCC, ktorý vyžaduje rozpustenie AJ.Okrem toho mutanty Specc11 majú zníženú signalizáciu PI3K-AKT a zvýšenú apoptózu.In vitro bola mierna inhibícia signalizácie PI3K-AKT v bunkách divokého typu dostatočná na vyvolanie zmien AJ.Dôležité je, že zmeny AJ vyvolané knockdownom SPECC1L možno zvrátiť aktiváciou dráhy PI3K-AKT.Celkovo tieto údaje naznačujú, že SPECC1L, ako nový regulátor signalizácie PI3K-AKT a biológie AJ, je potrebný na uzavretie neurálnej trubice a stratifikáciu CNCC.
Bunky lebečného neurálneho hrebeňa (CNCC) sa lokalizujú do dorzálneho neuroektodermu a oddeľujú sa od neuroepitelu vyvíjajúcich sa nervových záhybov prostredníctvom procesu zahŕňajúceho epitelovo-mezenchymálny prechod (EMT)1,2,3.Premigrujúce epiteliálne CNCC narušujú medzibunkové spojenia a stávajú sa migrujúcimi mezenchymálnymi CNCC, ktoré vyplňujú prvý a druhý faryngálny oblúk a tvoria väčšinu kraniofaciálnej chrupavky.Gény, ktoré regulujú funkciu CNCC, sú teda často narušené v etiológii kraniofaciálnych vrodených anomálií, ako sú orofaciálne rázštepy, ktoré najčastejšie postihujú 1/800 pôrodov len v USA.Jedna z vrodených deformít8.
Delaminácia CNCC sa zhoduje s uzavretím prednej nervovej trubice medzi 8, 5 a 9, 5 dňami embryonálneho vývoja u myší.Mutanty množstva myších génov spojených s orofaciálnym rázštepom tiež vykazujú určitú formu defektu neurálnej trubice, vrátane Irf69,10, Ghrl310, Cfl111 a Pdgfra12.Procesy uzatvárania neurálnej trubice a stratifikácie CNCC však možno považovať za nezávislé, pretože mutantná myš Splotch (Pax3) vykazuje defekty v uzavretí neurálnej trubice bez akéhokoľvek vplyvu na stratifikáciu alebo migráciu CNCC 13, 14.Ďalšie modely myší s defektmi v CNCC disekcii a uzavretí neurálnej trubice pomôžu vymedziť spoločný molekulárny základ týchto dvoch procesov.
Izolácia CNCC z neuroepiteliálnych buniek vyžaduje rozpustenie adhezívnych spojení (AJ), ktoré sú zložené z proteínových komplexov obsahujúcich okrem iného E-kadherín, β-katenín, α-E-katenín a α-aktinín spojený s aktínovými vláknami 2 Štúdie nadmernej expresie E-kadherínu v nervových záhyboch ukázali zníženie alebo oneskorenie v delaminácii CNCC.Naopak, supresia E-kadherínu vedie k skorej stratifikácii15,16.Mnohé z faktorov, ktoré sprostredkovávajú EMT počas stratifikácie CNCC, sú transkripčné faktory (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) a proteíny remodelujúce extracelulárnu matricu (ECM), ako sú matricové metaloproteinázy (MMP), avšak CNCC sú priame cytoskeletálne AJ regulátory. zatiaľ neznáme.Je známe, že dráha PI3K-AKT antagonizuje hladiny E-kadherínu, najmä z výskumu rakoviny17.Nedávne štúdie ukázali, že strata signalizácie PI3K-AKT na báze PDGFa u myší vedie ku kraniofaciálnym abnormalitám vrátane rázštepu podnebia a defektov neurálnej trubice12.Vzťah medzi dráhou PI3K-AKT a stabilitou AJ pri stratifikácii CNCC je však nejasný.
Predtým sme identifikovali SPECC1L ako prvý mutantný gén u dvoch ľudí s ťažkou štrbinou, ktorá sa tiahne od úst k oku, známa ako šikmá štrbina (ObFC) alebo Tessier IV18 štrbina.Mutácie SPECC1L boli identifikované v dvoch viacgeneračných rodinách s autozomálne dominantným Opitz G/BBB syndrómom (OMIM #145410), v ktorých postihnutí jedinci vykazovali hypervzdialenosť a rázštep pery/podnebia19, a v jednej rodine so syndrómom nadmernej vzdialenosti tibi (OMIM #145420)20 .viac ako polovica prípadov Opitz G/BBB syndrómu je viazaná na X (OMIM #300000) a je spôsobená mutáciami v géne MID1, ktorý kóduje proteín 22 bunkového skeletu asociovaného s mikrotubulami.Predpokladáme, že SPECC1L, tiež proteín spojený s mikrotubulmi a aktínovým cytoskeletom, môže sprostredkovať signalizáciu potrebnú na remodeláciu aktínového cytoskeletu počas bunkovej adhézie a migrácie 18 .Prostredníctvom štúdií in vitro a in vivo teraz opisujeme SPECC1L ako nový regulátor stability AJ prostredníctvom signalizácie PI3K-AKT.Na bunkovej úrovni mal deficit SPECC1L za následok zníženie hladiny proteínu pan-AKT a zvýšenie apikálno-bazálnej disperzie AJ, čo bolo eliminované chemickou aktiváciou dráhy AKT.In vivo embryá s deficitom Specc11 vykazujú zhoršené uzatvorenie neurálnej trubice a zníženú disekciu CNCC.SPECC1L teda funguje vo vysoko regulovanej signalizácii založenej na bunkovej adhézii potrebnej pre normálnu funkciu CNCC počas morfogenézy tváre.
Na charakterizáciu úlohy SPECC1L na bunkovej úrovni sme použili predtým opísanú stabilnú bunkovú líniu osteosarkómu U2OS deficitnú v SPECC1L18.Tieto stabilné bunky U2OS s knockdownom SPECC1L (kd) mali mierny (60–70 %) pokles hladín transkriptov a proteínov SPECC1L, spolu s defektmi v migrácii a reorganizácii aktínového cytoskeletu 18. Naopak, závažný prechodný pokles v Ukázalo sa, že SPECC1L vedie k mitotickým defektom23.Po ďalšej charakterizácii sme zistili, že naše stabilné bunky SPECC1L-kd zmenili morfológiu pri veľmi vysokom stupni konfluencie (obrázok 1).Jednotlivé kontrolné bunky a kd bunky pri nízkej konfluencii vyzerali podobne (obrázok 1A, D).24 hodín po fúzii si kontrolné bunky zachovali svoj kvádrový tvar (obr. 1B, E), zatiaľ čo bunky SPECC1L-kd sa predlžovali (obr. 1C, F).Rozsah tejto zmeny v tvare buniek bol zachytený in vivo živým zobrazovaním kontrolných buniek a buniek kd (film 1).Aby sme určili úlohu SPECC1L v konfluentných bunkách, najprv sme skúmali jeho expresiu.Zistili sme, že hladiny proteínu SPECC1L sa po fúzii zvýšili (obrázok 1G), zatiaľ čo hladiny transkriptov SPECC1L sa nezvýšili (obrázok 1H).Okrem toho, keď sa hustota buniek zvyšovala, proteín SPECC1L sa akumuloval na medzibunkových hraniciach (obr. 2A-E), pričom vzor sa prekrýval so vzorom β-katenínu spojeného s membránou (obr. 2A'-E').Vzhľadom na asociáciu SPECC1L s aktínovým cytoskeletom 18, 23 sme predpokladali, že SPECC1L interaguje s adhezívnymi spojeniami na báze aktínu (AJ).
(AF) Bunky SPECC1L knockdown (DF) sa predlžujú pri vysokej konfluencii (F) v porovnaní s kontrolnými bunkami U2OS (AC).Tu sú zobrazené tri zo šiestich časových bodov (T1, T3, T6), ktoré sme vybrali pre rôzne hustoty buniek.(G) Western blot analýza ukazuje, že proteín SPECC1L je stabilizovaný pri vysokom stupni konfluencie v porovnaní s nízkym stupňom konfluencie v kontrolných bunkách.Western blot SPECC1L ukazuje očakávaný pás 120 kDa a pás s vyššou molekulovou hmotnosťou, pravdepodobne posttranslačne modifikovaný (*).Analýza Western blot sa uskutočnila za rovnakých podmienok pre nízku a vysokú konfluenciu.Obrázky ukazujúce SPECC1L pri nízkom a vysokom sútoku sa získali z rovnakého blotu.Rovnaká škvrna bola odstránená a znovu skúmaná s P-aktínovou protilátkou.(H) Kvantitatívna RT-PCR analýza neukázala žiadne významné zmeny v hladinách transkriptov SPECC1L.Chybové stĺpce predstavujú SEM zo štyroch nezávislých experimentov.
(AE) Vybrali sme šesť časových bodov (T1-T6) predstavujúcich rozsah bunkových hustôt na normalizáciu analýzy tvaru buniek a zmien AJ v bunkách U2OS s knockdown SPECC1L (kd).Prvých päť z týchto časových bodov zahŕňalo jednotlivé bunky (T1), 50-70% fúziu malých bunkových zhlukov (T2), fúziu bez pretvorenia buniek kd (T3), pretvorenie buniek kd (T4) a 24-hodinové zmeny.v zadnej forme buniek kd (T5).Proteín SPECC1L bol prevažne dispergovaný v cytoplazme v T1 (A), ale jeho akumulácia bola pozorovaná na medzibunkových hraniciach v nasledujúcich časových bodoch (B–E, šípky).(FJ) β-katenín vykazuje podobnú akumuláciu na medzibunkových hraniciach spojenú s komplexom AJ.(A'-E') SPECC1L a β-katenín vykazujú prekrývajúce sa farbenie na hraniciach buniek pri vysokej hustote buniek (šípky).(F'-J') V bunkách SPECC1L-kd sa farbenie β-katenínu javí ako normálne pri nízkej hustote buniek (F'-H'), ale rozširuje sa, keď sa mení tvar buniek (I', J'; šípky), čo naznačuje, že AJ zmenili sa.Stĺpce = 10 um.
Potom sme sa pokúsili určiť vplyv nedostatku SPECC1L na AJ.Použili sme niekoľko markerov spojených s AJ, vrátane kanonických zložiek F-aktín, myozín IIb, β-katenín a E-kadherín24,25,26,27.Aktínové stresové vlákna sa zvýšili v bunkách SPECC1L-kd, ako už bolo opísané (obr. 3A, B)18.Myozín IIb spojený s aktínovými vláknami vykazoval podobný nárast v bunkách SPECC1L-kd in vitro (obr. 3C, D).AJ-asociovaný β-katenín sa viaže na kadherín na bunkovej membráne, čo ukazuje normálny „voštinový“ expresný vzor v kontrolných kubocytoch (obr. 3E,G).Je zaujímavé, že na plochých snímkach s použitím konfokálnej mikroskopie vykazovalo farbenie β-katenínu (obr. 3E, F) a E-kadherínu (obr. 3G, H) na bunkovej membráne konfluentných buniek s deficitom SPECC1L výrazné vzory rozšíreného farbenia.Táto expanzia AJ-asociovaného β-katenínu v bunkách kd bola najvýraznejšia pri konfluencii, ale zdalo sa, že predchádza zmenám v tvare buniek (obr. 2F-J, F'-J').Aby sme určili fyzikálnu povahu tohto rozšíreného farbenia AJ, skúmali sme hranice buniek na apikálno-bazálnom povrchu buniek SPECC1L-kd U2OS transmisnou elektrónovou mikroskopiou (TEM) (obrázok 3I, J).Na rozdiel od kontrolných buniek (obr. 31), ktoré mali oddelené oblasti s elektrónovou hustotou indikujúce AJ (šípky), bunky kd (obr. 3J) vykazovali veľké, súvislé oblasti s vysokou elektrónovou hustotou indikujúcou AJ pozdĺž apikobazálnej roviny..Okrem toho sme na priečnych rezoch pozorovali rozsiahle záhyby bunkovej membrány v bunkách kd (obr. S1A,B), čo vysvetľuje rozšírený vzor pásov farbenia β-katenínu a E-kadherínu (obr. 3F,H).Na podporu úlohy SPECC1L v AJ sa β-katenín koimunoprecipitoval so SPECC1L v lyzátoch konfluentných buniek U2OS (obr. 3K).Spolu s rozšíreným imunofarbením na markery AJ bola analýza TEM v súlade s našou hypotézou, že nedostatok SPECC1L zvyšuje apikálno-bazálnu hustotu a rozptyl.
(AH) Zvýšené farbenie F-aktínu v bunkách kd 48 hodín po fúzii (T6; A, B).Zmenené farbenie myozínu IIb spojeného s F-aktínom (C, D).Hladký vzor farbenia β-katenínu a E-kadherínovej membrány v kontrolných bunkách (E, G) sa zvýšil v bunkách SPECC1L-kd (F, H).Stĺpce = 10 um.(I–J) Elektrónové mikrofotografie pozorujúce apikálno-bazálne medzibunkové spojenie.Kontrolné bunky vykazujú odlišné oblasti s hustotou elektrónov, čo naznačuje lepkavé spojenia (I, šípky).Na rozdiel od toho sa celé apikálno-bazálne spojenie v bunkách SPECC1L-kd javilo ako elektrónové husté (J, šípky), čo naznačuje zvýšenú hustotu a disperziu adhezívnych spojení.(K) β-katenín sa koimunoprecipitoval so SPECC1L v konfluentných bunkových lyzátoch U2OS.Obrázok urobený z jedného miesta predstavujúce jeden zo štyroch nezávislých experimentov.
Aby sme pochopili úlohu SPECC1L v kraniofaciálnej morfogenéze, vytvorili sme myšací model s deficitom Specc1l pomocou dvoch nezávislých bunkových línií ES pasce, DTM096 a RRH048 (BayGenomics, CA), ktoré predstavujú intrón 1 a transkripty Specc1l boli zachytené pri 15 (obr. 1) .4A, obrázok S2).Genomické umiestnenie inzertu návnadového vektora sa určilo sekvenovaním celého genómu a potvrdilo sa pomocou PCR (obr. S2).Oba návrhy génových pascí tiež umožnili po zachytení fúziu reportérov Specc11-lacZ v rámci.Preto sa ako indikátor expresie Specc11 použila expresia lacZ stanovená farbením X-gal.Obe alely vykazovali podobné vzory expresie lacZ, pričom génová pasca DTM096 v intróne 1 vykazovala silnejšiu expresiu ako RRH048 v intróne 15 (nezobrazené).Specc1l je však široko exprimovaný, s obzvlášť silnou expresiou v nervových záhyboch na E8.5 (obrázok 4B), v neurálnej trubici a tvárových procesoch na E9.5 a E10.5 (obrázok 4C, D) a vo vyvíjajúcich sa končatinách. na E10.5 a oči (obrázok 4D).Už sme predtým uviedli, že expresia SPECC1L v prvom hltanovom oblúku na E10.5 bola prítomná v epiteli a podkladovom mezenchýme18, čo je v súlade s líniou CNCC.Na testovanie expresie SPECC1L v CNCC sme vykonali E8.5 nervové záhyby (obrázok 4E-J) a E9.5 rezy lebky (obrázok 4K-).Pri E8.5 SPECC1L intenzívne farbil nervové záhyby (obr. 4E, H), vrátane buniek zafarbených NCC markermi (obr. 4G, J).Pri E9.5 SPECC1L (obr. 4K, N) silne zafarbený migrujúci CNCC zafarbený spolu s AP2A (obr. 4L, M) alebo SOX10 (obr. 40, P).
(A) Schematické znázornenie myšacieho génu Specc11 ukazujúce inzerciu návnadového vektora do bunkových klonov ES DTM096 (intrón 1) a RRH048 (intrón 15).(BD) lacZ farbenie heterozygotných embryí SpecclDTM096 reprezentujúcich expresiu Speccll od E8.5 do E10.5.NE = neuroektoderm, NF = nervový záhyb, PA1 = prvý faryngálny oblúk.(EP) Imunofarbenie SPECC1L s NCC markermi AP2A a SOX10 v E8.5 (NF; EJ) nervových záhyboch a E9.5 (KP) rezoch lebky.Farbenie SPECC1L bolo široko pozorované v nervových záhyboch E8.5 (E, H; šípky), vrátane buniek označených AP2A (F, G; šípky) a SOX10 (I, J; šípky).Pri E9.5 SPECC1L silne zafarbil migrujúce CNCC (K, N; šípky) označené AP2A (L, M; šípky) a SOX10 (O, P; šípky).
Kríženie medzi heterozygotnými myšami Specc1lDTM096/+ a Specc1lRRH048/+ ukazuje, že tieto dve alely génovej pasce nie sú komplementárne a že zložené heterozygoty a embryonálne homozygoty pre každú alelu génovej pasce sú embryonálne letálne (tabuľka S1).Mendelovské pomery naznačovali zníženie miery prežitia heterozygotov pri narodení (očakávané 1,34 vs. 2,0).U heterozygotov sme zaznamenali nízku perinatálnu úmrtnosť, niektorí mali kraniofaciálne anomálie (obr. S3).Nízka penetrácia týchto perinatálnych kraniofaciálnych fenotypov však sťažuje štúdium ich základných patofyziologických mechanizmov.Preto sme sa zamerali na embryonálny letálny fenotyp homozygotných mutantov Specc11.
Väčšina zložených heterozygotných alebo homozygotných mutantných embryí Specc1lDTM096/RRH048 sa nevyvinula po E9,5–10,5 (obr. 5A–D) a nervová trubica sa neuzavrela vpredu (obr. 5B, D) a niekedy sa uzavrela aj zozadu (nezobrazené). ..Tento defekt uzáveru lebečnej neurálnej trubice bol spojený s väčšinou CNCC označených DLX2 zostávajúcimi v nervových záhyboch pri E10.5, čo naznačuje, že nedošlo k disekcii (obrázok 5A'-D').Aby sme zistili, či sa znížila aj celková veľkosť CNCC, označili sme línie CNCC pomocou GFP v našich líniách génových pascí pomocou Wnt1-Cre a ROSAmTmG.Streamujeme triedené GFP+ NCC a GFP- (RFP+) non-NCC z celých embryí.V E9.5 sa podiel prietokovo triedených CNCC značených GFP významne nezmenil medzi WT a mutantnými embryami (nie je znázornené), čo naznačuje normálnu špecifikáciu CNCC.Preto sme predpokladali, že zvyškové farbenie Wnt1-Cre a DLX2 v exponovaných nervových záhyboch (obrázok 5B') bolo spôsobené chybným vrstvením CNCC, pravdepodobne v dôsledku zvýšenej hustoty alebo disperzie buniek AJ, ako je vidieť v bunkách SPECC1L-kd.Na potvrdenie prítomnosti CNCC v nervovom záhybe sme použili NCC markery SOX10, AP2A a DLX2 (obrázok 5E-R).V E8.5 sa v rezoch WT (obr. 5E, G, I) a mutantu Speccll (obr. 5F, H, J) pozorovalo zafarbenie nervových záhybov pre všetky tri markery NCC.V E9.5, zatiaľ čo NCC markery farbili migrujúce NCC v rezoch WT (obr. 5M, O, Q), reziduálne farbenie NCC bolo pozorované v exponovaných nervových záhyboch mutantných embryí Speccll (obr. 5N, P, R).Pretože SOX10 a DLX2 označujú migrujúce CNCC, tento výsledok naznačuje, že CNCC s deficitom SPECC1L dosahujú špecifikáciu po migrácii, ale nedokážu migrovať z nervových záhybov.
Nedostatok Specc11 vedie k chybnému uzavretiu neurálnej trubice, delaminácii buniek lebečnej neurálnej lišty a AJ.
(A, B') E9.5 WT (A) Embryo nesúce migrujúce bunky lebečnej neurálnej lišty (CNCC) označené Wnt1-Cre (A').Naproti tomu mutantné embryá Specc11 vykazujú otvorené nervové záhyby (B), šípky) a CNCC, ktoré nemigrovali (B', šípky).(C, D') Snímky svetlého poľa (C, D') a imunofarbenie (C', D') CNCC markera DLX2 embryí E10.5 WT (C, C') a Speccll (D, D').V embryách WT E10.5 DLX2-pozitívne CNCC kolonizujú žiabrové oblúky (C', šípky), zatiaľ čo u mutantov pretrváva nápadné sfarbenie v otvorených nervových záhyboch (D', šípky) a v prvých hltanových oblúkoch (D', šípky).) s určitým zafarbením (šípky), ktoré naznačujú slabú delamináciu a migráciu CNCC.ER) Rezy mutantných embryí WT a Specc1l v štádiách E8.5 (E–L) a E9.5 (M–R) boli označené NCC markermi SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, O, P) a DLX2 (I, J, Q, R).V E8.5 bolo pozorované NCC farbenie v divokých typoch nervových záhybov (NF) a mutantných rezoch.Spoločné farbenie SOX10 a β-katenínu v E8.5 WT (K) a mutante (L) odhalilo zvýšené farbenie β-katenínu na hraniciach buniek v nervových záhyboch.V E9.5 sa pozorovalo farbenie migrujúcich CNCC divokého typu (M, O, Q), zatiaľ čo v mutantoch nestratifikované CNCC farbili otvorené nervové záhyby (N, P, R).(S–Z) In vivo analýza značenia AJ v koronálnych rezoch embryí WT a Specc11DTM096/RRH048 s mutáciou E9.5.V pravom hornom rohu je zobrazená približná rovina rezu.V rezoch mutantných tkanív sa pozorovalo zvýšené zafarbenie F-aktínu (S, T) a myozínu IIb (U, V).Podobne ako v prípade výsledkov in vitro na obr. 3 sa u mutantných embryí pozorovalo zosilnené membránové farbenie na β-katenín (W, X) a E-kadherín (Y, Z).(AA-BB) Elektrónový mikrosnímok rezu embrya divokého typu, ktorý sa pozerá za hranicu apikálno-bazálnej bunky, ukazuje zreteľnú oblasť s hustotou elektrónov, ktorá naznačuje adhézne spojenia (AA, šípky).Naopak, v sekciách mutantných embryí Specc11 (BB, šípky) je celé apikobazálne spojenie elektrónovo husté, čo naznačuje zvýšenú hustotu a disperziu adhezívnych spojení.
Aby sme otestovali našu hypotézu, že znížené vrstvenie je spôsobené zmeneným AJ, skúmali sme AJ značenie v exponovaných nervových záhyboch mutantných embryí Speccll (obr. 5S-Z).Pozorovali sme nárast aktínových stresových vlákien (obr. 5S, T) a súčasne zvýšenú lokalizáciu zafarbenia myozínu IIB na aktínových vláknach (obr. 5U, V).Dôležité je, že sme pozorovali zvýšené zafarbenie β-katenínu (obr. 5W,X) a E-kadherínu (obr. 5Y,Z) na medzibunkových hraniciach.Tiež sme skúmali β-katenínové farbenie NCC v nervových záhyboch embryí E8.5 (obr. 5K, L).Farbenie β-katenínu sa zdalo byť silnejšie v mutantných nervových záhyboch Speccll (obr. 5L a K), čo naznačuje, že sa začali zmeny AJ.Na elektrónových mikrofotografiách rezov lebky embryí E9.5 sme opäť pozorovali zvýšené difúzne elektrón-denné farbenie u mutantných embryí Speccll v porovnaní s WT (obr. 5AA, BB a S1E-H).Celkovo tieto výsledky podporujú naše výsledky in vitro v bunkách SPECC1L-kd U2OS a naznačujú, že aberantné farbenie AJ ​​predchádza stratifikácii CNCC v našich mutantných embryách.
Vzhľadom na známy antagonistický vzťah medzi aktivitou AKT a stabilitou E-kadherínu17,28 sme predpokladali zapojenie signalizácie PI3K-AKT.Okrem toho sme pozorovali subepidermálne pľuzgiere v niektorých našich mutantných embryách, ktoré unikli letalite (<5%) pri E9,5-10,5 a namiesto toho sa usadili okolo E13,5 (obr. S3).Subepidermálne vezikuly sú charakteristickým znakom zníženej signalizácie PI3K-AKT na základe PDGFRa12.Fantauzzo a kol.(2014) uviedli, že narušenie aktivácie PI3K založenej na PDGFRα v mutantných embryách PdgfraPI3K / PI3K má za následok subepidermálne vezikuly, defekty neurálnej trubice a fenotypy rázštepu podnebia.Hladiny pan-AKT a aktívneho fosforylovaného Ser473-AKT boli skutočne znížené in vivo v tkanivách mutantu Speccl1 na zastavenie embrya E9.5 (obr. 6A-D).Pokles hladín fosforylovaného Ser473-AKT môže byť úplne spôsobený znížením hladín pan-AKT in vivo (obr. 6E) a in vitro (obr. 6F).Pokles in vitro sa pozoroval iba vtedy, keď bunky U2OS boli silne konfluentné so zmenami v tvare buniek a hustote AJ (obrázok 6D).Naše údaje teda naznačujú, že SPECC1L je nový pozitívny regulátor signalizácie PI3K-AKT v kraniofaciálnej morfogenéze.
(A–E) E8.5 (A,B) a E9.5 (C,D) rezy lebky alebo E9.5 lyzáty z mutantných embryí Speccll (E) vykazujúce hladiny aktívnej fosforylovanej S473-AKT a pan-AKT redukcie proteínu v porovnaní s kontrolným WT.Western blot sa uskutočnil na lyzátoch divokého typu a mutantných lyzátoch za rovnakých podmienok.Obrázky zobrazené pre SPECC1L boli odobraté z jedného blotu.Rovnaký blot sa odstránil a znova sa skúmal s anti-pan-ACT a p-aktínovými protilátkami.Hladiny pan-AKT v E8.5 nervových záhyboch (A, B) a hladiny fosforylovaného S473-AKT v E9.5 rezoch lebky boli významne znížené.(F) Hladiny Pan-AKT boli podobne znížené v lyzátoch buniek SPECC1L-kd U2OS zozbieraných pri vysokej konfluencii.Chybové stĺpce predstavujú SEM z troch nezávislých kvantifikácií Western blot.(GJ) Rezy embryí WT v E9.5 zafarbené KI67 a štiepenou kaspázou 3, v danom poradí, vykazujúce bunkovú proliferáciu (G, G') a malú apoptotickú aktivitu (H, H').Mutantné embryá Specc11 vykazujú porovnateľnú bunkovú proliferáciu (I), ale počet buniek podliehajúcich apoptóze je výrazne zvýšený (J).
Potom sme skúmali markery proliferácie a apoptózy.Nepozorovali sme žiadny rozdiel v proliferácii embryí E9.5 (obr. 6E, G v porovnaní s I) s indexom proliferácie 82,5 % pre mutanty WT a 86,5 % pre mutanty Specc1l merané farbením KI67 (p < 0,56, Fisher's presný test).Podobne sme nepozorovali žiadny rozdiel v apoptóze meranej farbením na štiepenú kaspázu 3 v nervových záhyboch pri E8,5 až do zastavenia embrya (nezobrazené) (nezobrazené).Na rozdiel od toho bola apoptóza významne zvýšená vo všetkých E9.5 mutantných embryách (obr. 6F, H a J).Toto celkové zvýšenie apoptózy je v súlade so zníženou signalizáciou PI3K-AKT a včasnou embryonálnou letalitou29,30,31.
Ďalej, aby sme potvrdili kauzálnu úlohu signalizácie PI3K-AKT v zmenách AJ v našich kd bunkách, chemicky sme zmenili dráhu v kontrolných a kd bunkách (obrázok 7A-F).Ako marker sme použili fenotyp zmeny tvaru bunky pozorovaný v konfluentných bunkách SPECC1L-kd, ktorý sme kvantifikovali pomocou pomeru najdlhšieho rozmeru (dĺžky) k zodpovedajúcemu vertikálnemu rozmeru (šírke).Pre relatívne okrúhle alebo kvádrové bunky sa očakáva pomer 1 (obrázok 7G).Okrem tvaru buniek sme tiež potvrdili vplyv na AJ farbením β-katenínu (obr. 7A'-F').Inhibícia dráhy PI3K-AKT pomocou wortmannínu bola dostatočná na zmenu tvaru buniek v kontrolných bunkách (obrázok 7A, C) a AJ (obrázok 7A').PI3K-AKT aktivátor SC-79 neovplyvnil tvar buniek (obr. 7A, E) ani expanziu AJ (obr. 7A') v kontrolných bunkách.V bunkách SPECC1L-kd viedlo ďalšie potlačenie dráhy PI3K-AKT k zvýšenej apoptóze (obr. 7B, D) a výraznému zvýšeniu zafarbenia β-katenínu (obr. 7B'), čo je v súlade s našimi ťažkými mutantmi in vivo.Dôležité je, že aktivácia dráhy PI3K-AKT významne zlepšila tvar buniek (obrázok 7B, F) a fenotypy AJ (obrázok 7B“).Zmeny v tvare buniek boli kvantifikované ako pomer zaoblenia buniek (CCR) a porovnané z hľadiska významnosti, ako je opísané vyššie (obr. 7G).V kontrolných bunkách (obr. 7G, CCR = 1,56) bolo ošetrenie wortmanínom dostatočné na to, aby významne zmenilo tvar buniek (obr. 7G, CCR = 3,61, p < 2,4 × 10-9) v rozsahu podobnom pozorovanému v SPECC1L.-kd bunky (obr. 7G, CCR = 3,46).Ošetrenie buniek SPECC1L-kd wortmanínom (obr. 7G, CCR = 3,60, zanedbateľné) nebolo významnejšie ako neošetrené bunky kd (obr. 7G, CCR = 3,46, zanedbateľné) alebo kontrolné bunky ošetrené wortmannínom (obr. 7G)., CCR = 3,46, zanedbateľné) navyše ovplyvňuje predĺženie buniek (7G, CCR = 3,61, zanedbateľné).Najdôležitejšie je, že aktivátor SC-79 AKT obnovil predĺžený fenotyp buniek SPECC1L-kd (obr. 7G, CCR = 1,74, p < 6,2 × 10-12).Tieto výsledky potvrdzujú, že SPECC1L reguluje signalizáciu PI3K-AKT a naznačujú, že mierny pokles SPECC1L ovplyvňuje bunkovú adhéziu, zatiaľ čo silný pokles vedie k apoptóze (obr. 8).
(A–F') Kontrolné (A, C, E) a SPECC1L-kd (B, D, F) bunky ošetrené inhibítorom dráhy PI3K-AKT wortmannínom (C, D) alebo aktivátorom SC-79 (E, F) Liečba Neošetrené kontrolné bunky sú kvádrové (A) s normálnym farbením buniek β-cat (A'), zatiaľ čo bunky kd sú predĺžené (B) so zvýšeným farbením β-cat (B').Po potlačení dráhy PI3K-AKT sa kontrolné bunky predĺžili (C) s expanziou β-cat (C'), zatiaľ čo bunky kd začali podliehať apoptóze (D), podobne ako naše vysoko mutované embryá a vykazovali extrémne zvýšenú β-cat.farbenie (D').Po aktivácii dráhy PI3K-AKT kontrolné bunky zostali kvádrové (E) a mali normálne farbenie β-cat (E'), zatiaľ čo bunky kd vykazovali výrazne zlepšený tvar buniek (F) a farbenie β-cat (F'), čo naznačuje (G) Stupeň zmeny tvaru buniek v (AF) sa kvantifikoval pomocou pomeru zaoblenia buniek (CCR) najdlhšieho rozmeru (dĺžka) a zodpovedajúceho vertikálneho rozmeru (šírka) pomocou softvéru MetaMorph.Neošetrené (NT) bunky SPECC1L-kd (CCR = 3,46) boli významne dlhšie ako kontrolné bunky (CCR = 1,56, p < 6,1 × 10–13).Wortova inhibícia PI3K-AKT dráhy v kontrolných bunkách bola dostatočná na to, aby spôsobila podobné predĺženie v tvare buniek (CCR=3,61, p<2,4x10-9).Podobne aktivácia AKT pomocou SC-79 v bunkách SPECC1L-kd obnovila predĺženie buniek na kontrolné úrovne (CCR = 1,74, p < 6,2 × 10–12).Ošetrenie buniek SPECC1L-kd wortmanínom viedlo k zvýšenej apoptóze, ale žiadne ďalšie zvýšenie zmeny tvaru buniek (CCR=3,60) v porovnaní s neošetrenými kd (CCR=3,46, ns) alebo kontrolnými bunkami ošetrenými wortmannínom (3,61) pozorované v .ns = nezáleží.Sú zobrazené +/- SEM merania pre 50 buniek.Štatistické rozdiely sa vypočítali pomocou Studentovho t-testu.
(A) Schematické znázornenie inhibície a aktivácie dráhy PI3K-AKT, čo vedie k zmenám AJ a záchrane.(B) Navrhovaný model stabilizácie proteínu AKT pomocou SPECC1L.
Premigračné CNCC vyžadujú lýzu AJ na oddelenie od neuroepiteliálnych buniek predného nervového záhybu1, 15, 32.Zvýšené farbenie zložiek AJ a strata apikálno-bazálnej asymetrickej distribúcie AJ ​​v bunkách s deficitom SPECC1L in vitro aj in vivo v kombinácii s fyzickou blízkosťou SPECC1L k β-katenínu naznačujú, že SPECC1L funguje tak, aby správne udržiaval lokálnu stabilitu AJ pre organizačné svaly.aktínový cytoskelet.Asociácia SPECC1L s aktínovým cytoskeletom a β-katenínom a zvýšenie počtu kondenzovaných aktínových filamentov v neprítomnosti SPECC1L je v súlade s pozorovaným zvýšením hustoty AJ.Ďalšou možnosťou je, že zvýšený počet aktínových vlákien v bunkách s deficitom SPECC1L vedie k zmene medzibunkového napätia.Pretože bunkový stres ovplyvňuje dynamiku AJ 33, zmeny napätia môžu viesť k difúznejšiemu AJ 34.Akékoľvek zmeny teda ovplyvnia vrstvy CNCC.
Wnt1 je exprimovaný v skorých nervových záhyboch, ktoré spôsobujú vznik buniek neurálnej lišty.Sledovanie línie Wnt1-cre teda označuje NCC35 pred aj migráciou.Wnt1 však tiež označuje klony dorzálneho mozgového tkaniva odvodené tiež zo skorých nervových záhybov 35, 36 , vďaka čomu je pravdepodobné, že naše farbenie mutantov E9.5 pre markery Wnt1 v otvorených nervových záhyboch nie je CNCC.Naše pozitívne farbenie pre NCC markery AP2A a SOX10 potvrdilo, že exponované nervové záhyby mutantných embryí Specc11 skutočne obsahovali CNCC.Okrem toho, keďže AP2A a SOX10 sú markery včasnej migrácie NCC, pozitívne farbenie ukázalo, že tieto bunky sú postmigračné CNCC, ktoré nemožno stratifikovať pomocou E9.5.
Naše údaje naznačujú, že molekulárna regulácia AJ pomocou SPECC1L je sprostredkovaná signalizáciou PI3K-AKT.Signalizácia AKT je znížená v bunkách a tkanivách s deficitom SPECC1L.Zistenia Fantauzza a kol.podporujú priamu úlohu signalizácie PI3K-AKT v kraniofaciálnej morfogenéze.(2014) ukázali, že nedostatok aktivácie PI3K-AKT signalizácie založenej na PDGFRα vedie k fenotypu rázštepu podnebia.Ukazujeme tiež, že inhibícia dráhy PI3K-AKT je dostatočná na zmenu AJ a tvaru buniek v bunkách U2OS.V súlade s našimi zisteniami Cain a kol.37 ukázali, že downregulácia PI3K a110 podjednotky v endotelových bunkách vedie k podobnému zvýšeniu pericelulárneho farbenia β-katenínu, označovanému ako zvýšenie „indexu konektivity“.Avšak v endotelových bunkách, ktorých aktínové vlákna sú už vysoko organizované, má potlačenie dráhy PI3K-AKT za následok uvoľnený tvar buniek.Na rozdiel od toho bunky SPECC1L-kd U2OS vykazovali predĺžený tvar buniek.Tento rozdiel môže byť špecifický pre typ bunky.Zatiaľ čo potlačenie signalizácie PI3K-AKT permanentne ovplyvňuje aktínový cytoskelet, účinok na tvar buniek je určený zmenami napätia spôsobenými zmenami v hustote a organizácii centrálnych aktínových vlákien.V bunkách U2OS sme použili iba zmeny tvaru buniek ako marker zmeny a zotavenia AJ s deficitom SPECC1L.Na záver predpokladáme, že inhibícia dráhy AKT pri deficite SPECC1L zvyšuje stabilitu AJ a znižuje delamináciu v CNCC.
Je zaujímavé, že hladiny pan-AKT boli znížené in vitro a in vivo okrem fosforylovaných hladín 473-AKT v neprítomnosti SPECC1L, čo naznačuje reguláciu signalizácie PI3K-AKT na úrovni stability alebo obratu proteínu AKT.Gény SPECC1L a MID1, oba spojené s Opitz/GBBB syndrómom, kódujú proteíny, ktoré stabilizujú mikrotubuly18,22.Mechanizmus, ktorým SPECC1L a MID1 sprostredkúvajú stabilizáciu mikrotubulov, nie je úplne objasnený.V prípade SPECC1L táto stabilizácia zahŕňa zvýšenú acetyláciu podskupiny mikrotubulov18.Je možné, že SPECC1L používa podobný mechanizmus na stabilizáciu iných proteínov, ako je AKT.Ukázalo sa, že acetylácia lyzínových zvyškov v proteíne AKT vedie k zníženiu membránovej lokalizácie a fosforylácie38.Okrem toho je na jeho membránovú lokalizáciu a aktiváciu potrebná ubikvitinácia reťazca K63 na rovnakom lyzínovom zvyšku na AKT39, 40.Spomedzi niekoľkých faktorov interagujúcich s proteínmi SPECC1L identifikovanými v rôznych vysokovýkonných kvasinkových dvojhybridných skríningoch sa štyri – CCDC841, ECM2942, APC a UBE2I43 – podieľajú na obrate alebo stabilite proteínov prostredníctvom ubikvitinácie alebo sumoylácie.SPECC1L sa môže podieľať na posttranslačnej modifikácii lyzínových zvyškov AKT, čo ovplyvňuje stabilitu AKT.Kritická úloha SPECC1L pri lokalizácii a stabilite proteínu AKT však zostáva objasnená.
Závažné defekty v expresii SPECC1L in vivo viedli k zvýšenému farbeniu markerov AJ a defektnému prekrytiu CNCC, ako aj k zvýšenej apoptóze a skorej embryonálnej letalite.Predchádzajúce správy ukázali, že myšie mutanty so zvýšenými hladinami apoptózy sú spojené s defektmi neurálnej trubice 44, 45, 46, 47 a kraniofaciálnymi defektmi48.Bolo navrhnuté, že nadmerná bunková smrť v nervových záhyboch alebo hltanových oblúkoch môže viesť k nedostatočnému počtu buniek potrebných na správny morfogenetický pohyb 48, 49, 50.Na rozdiel od toho naše bunkové línie s deficitom SPECC1L so stredne zníženou expresiou SPECC1L vykazovali iba zmeny AJ bez dôkazu zvýšenej bunkovej smrti.Chemická inhibícia dráhy PI3K-AKT v týchto Kd bunkách však viedla k zvýšenej apoptóze.Mierny pokles expresie alebo funkcie SPECC1L teda zabezpečuje prežitie buniek.To je v súlade s pozorovaním, že zriedkavé mutantné embryá Specc11, ktoré uniknú zatknutiu pri sv.E9.5 - možno kvôli zníženej účinnosti zachytávania génov - sú schopné uzavrieť svoje nervové trubice a zastaviť sa neskôr vo vývoji, často s kraniofaciálnymi defektmi (obr. S3).V súlade s tým je aj zriedkavý výskyt heterozygotných embryí Specc1l s kraniofaciálnymi abnormalitami – pravdepodobne v dôsledku zvýšenej účinnosti zachytávania génov – ako aj nález u zebričiek, v ktorých jeden z dvoch ortológov SPECC1L (specc1lb) spôsobuje neskoré embryonálne fenotypy vrátane straty dolná čeľusť a obojstranné rázštepy51.Takže heterozygotné mutácie straty funkcie SPECC1L identifikované u ľudských pacientov môžu spôsobiť malé poruchy funkcie SPECC1L počas kraniofaciálnej morfogenézy, čo je dostatočné na vysvetlenie ich orofaciálnych rázštepov.Regulácia medzibunkových kontaktov založená na SPECC1L môže tiež hrať úlohu pri palatogenéze a fúzii faryngálnych oblúkov.Ďalšie štúdie funkcie SPECC1L pomôžu objasniť úlohu dočasných medzibunkových kontaktov v CNCC počas uzavretia neurálnej trubice v motilite neuroepiteliálnych buniek a kraniofaciálnej morfogenéze.
Kontrola osteosarkómu U2OS a bunky SPECC1L-kd boli opísané skôr (Saadi et al., 2011).Protilátky proti SPECC1L boli tiež charakterizované predtým (Saadi et al., 2011).Protilátky proti β-katenínu (králik; 1:1000; Santa Cruz, Dallas, TX) (myš; 1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), myozín IIb (1:1000; Sigma-Aldrich, St. Louis ), MO) ), E-kadherín (1:1000; Abkam, Cambridge, MA), AP2A (1:1000; Novus Biologicals, Littleton, Colorado), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, San Diego , Kalifornia), DLX2 (1:1000; Abcam, Cambridge, MA), fosfo-Ser473-AKT (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), pan-AKT (1:1000; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA ), KI67 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), štiepená kaspáza 3 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA) a β-aktín (1:2500; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) sa použil tak, ako je opísané..Aktínové vlákna boli zafarbené s Acti-stain rodamín faloidínom (Cytoskeleton, Denver, Colorado).
Kontrolné bunky U2OS a bunky SPECC1L-kd sa kultivovali v štandardnom DMEM s vysokým obsahom glukózy doplnenom 10 % fetálnym hovädzím sérom (Life Technologies, Carlsbad, CA).Na zmeny AJ sa 2 x 105 buniek naočkovalo na sklo ošetrené 0,1 % bravčovou želatínou (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) a pozorovali sa zmeny v tvare buniek.Bunky sa zbierali v rôznych časových bodoch: 4 hodiny po nasadení (t = 1), 24 hodín po nasadení (t = 2), konfluencia bez zmeny tvaru buniek (t = 3), zmena tvaru buniek (t = 4) 24 hodín po zmene tvaru bunky (t = 5) a 48 hodín po zmene tvaru bunky (t = 6) (obr. 1, 2, 3).Na moduláciu dráhy PI3K-AKT sa bunky kultivovali v uvedených koncentráciách s inhibítorom PI3K-AKT wortmannínom (TOCRIS Biosciences, Minneapolis, Minnesota) alebo aktivátorom SC-79 (TOCRIS Biosciences, Minneapolis Adams, Minnesota).Médium obsahujúce chemikálie sa vymieňalo denne.
Záznamy po jednotlivých snímkach sa uskutočňovali na živých kontrolných bunkách a bunkách KD za normálnych kultivačných podmienok a každých 10 minút sa počas 7 dní zbierali snímky fázového kontrastu.Snímky sa získali pomocou počítačom riadeného inverzného mikroskopu Leica DM IRB vybaveného mechanickým stolíkom a objektívom 10 x N-PLAN pripojeným ku kamere QImaging Retiga-SRV.Počas zobrazovania sa bunkové kultúry udržiavali pri 37 °C vo vlhkej atmosfére s 5 % CO2.
Dve bunkové línie ES génových pascí DTM096 a RRH048 z Regional Mutant Mouse Resource Center (UC Davis, CA) boli použité na vytvorenie Specc11 deficitných myších línií, označených SpeccllgtDTM096 a SpeccllgtRRH046.Stručne, 129/REJ ES bunky boli injikované do C57BL6 blastocyst.Výsledné chimérické samce myší sa rozmnožili so samicami myší C57BL6, aby sa identifikovali potomkovia so sfarbením srsti aguti.Prítomnosť vektorových inzertov génovej pasce sa použila na identifikáciu heterozygotov.Myši boli chované na zmiešanom pozadí 129/REJ;C57BL6.Umiestnenie miesta inzercie vektora genetickej pasce bolo potvrdené RT-PCR, sekvenovaním genómu a genetickou komplementáciou (doplnkový obrázok 1).Na sledovanie CNCC línie dvojitých heterozygotných myší Specc11GT boli skrížené myši ROSAmTmG (#007576) a Wnt1-Cre (#003829) (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME), aby sa vytvorila alela ROSAmTmG a Wnt1-Cre v mutantných embryách Spec.cll.Všetky experimenty na myšiach sa uskutočňovali podľa protokolov schválených Inštitucionálnym výborom pre starostlivosť o zvieratá a používanie zvierat z University of Kansas Medical Center.
Embryá boli fixované v (1 % formaldehyd, 0,2 % glutaraldehyd, 2 mM MgCl2, 0,02 % NP-40, 5 mM EGTA) počas 60 minút pri teplote miestnosti.Po fixácii v roztoku na farbenie X-gal (5 mM ferikyanid draselný, 5 mM ferokyanid draselný, 2 mM MgCl2, 0,01 % deoxycholát sodný, 0,02 % NP-40, 1 mg/ml X-gal) sa farbivo vyvinulo pri 37 °C .°C v priebehu 1-6 hodín.Embryá boli dodatočne fixované v 4% PFA a vizualizované.
Pre Western blotting boli bunky lyzované v pasívnom lyzovacom pufri (Promega, Fitchburg, WI) doplnenom zmesou inhibítorov proteázy HALT (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).Lyzáty boli spracované na 12% polyakrylamidových Mini-PROTEAN TGX hotových géloch (Bio-Rad, Hercules, CA) a prenesené na membrány Immobilon PVDF (EMD Millipore, Billerica, MA).Membrány boli blokované v 5 % mlieku v PBS obsahujúcom 0,1 % Tween.Protilátky sa inkubovali cez noc pri 4 °C alebo jednu hodinu pri teplote miestnosti.Na generovanie signálu sa použilo činidlo Femto SuperSignal West ECL (Thermo Scientific, Waltham, MA).Na imunofarbenie boli embryá fixované cez noc v 4% PFA/PBS a kryokonzervované.Tkanivové kryorezy boli blokované v PBS obsahujúcom 1 % normálne kozie sérum (Thermo Scientific, Waltham, MA) a 0,1 % Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) a potom inkubované pri 4 °C v inkubátore počas noc.s anti-protilátkou a fluorescenčnou sekundárnou protilátkou (1:1000) počas 1 hodiny pri 4 °C.Zafarbené rezy sa umiestnili do zlatého média ProLong (Thermo Scientific, Waltham MA) a ploché snímky sa získali pomocou konfokálneho mikroskopu Leica TCS SPE.Každé imunofarbenie sa uskutočnilo ako tri nezávislé experimenty na cirosekciách aspoň dvoch mutantných embryí.Je znázornený reprezentatívny experiment.
Bunky sa inkubovali v modifikovanom RIPA pufri (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 % NP-40, 130 mM NaCl, 10 % glycerol, 2 mM EDTA a inhibítor proteázy HALT (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) Stručne povedané, lyzáty boli predčistené magnetickými guľôčkami s proteínom G (Life Technologies, Carlsbad, CA) a potom inkubované cez noc pri 4 °C s anti-SPECC1L alebo IgG proteínovými guľôčkami s proteínom G, ktoré boli použité na extrakciu SPECC1L a Western blotting bol uskutočnený s použitím anti-SPECC1L. -P-katenínová protilátka opísaná vyššie Uvedené ko-IP experimenty reprezentujú štyri nezávislé experimenty.
Fixované kultivované bunky alebo myšacie embryonálne tkanivá boli poskytnuté do centra elektrónovej mikroskopie na University of Kansas Medical Center.Stručne, vzorky sa vložili do živice EMbed 812 (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA), polymerizovali sa cez noc pri 60 °C a narezali pri 80 nm pomocou ultramikrotómu Leica UC7 vybaveného diamantovou čepeľou.Rezy boli vizualizované použitím JEOL JEM-1400 transmisného elektrónového mikroskopu vybaveného 100 kV Lab6 pištoľou.
Ako citovať tento článok: Wilson, NR a kol.Nedostatok SPECC1L vedie k zvýšenej stabilite zostrihnutých kĺbov a zníženiu delaminácie buniek lebečnej neurálnej lišty.veda.6, 17735;doi:10.1038/srep17735 (2016).
Saint-Jeanne, J.-P.Indukcia a diferenciácia neurálnej lišty.(Springer Science + Business Media; Landes Bioscience/Eurekah.com, 2006).
Cordero, DR a kol.Bunky lebečnej neurálnej lišty v pohybe: ich úloha v kraniofaciálnom vývoji.American Journal of Medical Genetics.Časť A 155A, 270–279, doi:10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
Boland, RP Neurocristopathia: jej rast a vývoj v priebehu 20 rokov.Pediater.patológia.laboratórium.liek.17, 1-25 (1997).
Mangold E., Ludwig KU a Noten MM Prielom v genetike orofaciálnych rázštepov.Trends in Molecular Medicine 17, 725–733, doi:10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011).
Minu, M. a Riley, FM Molekulárne mechanizmy migrácie a vzorovania buniek lebečnej neurálnej lišty počas kraniofaciálneho vývoja.Vývoj 137, 2605–2621, doi: 10.1242/dev.040048 (2010).
Dixon, MJ, Marazita, ML, Beaty, TH a Murray, JK Rázštep pery a podnebia: pochopenie genetických a environmentálnych vplyvov.prirodzený komentár.Genetics 12, 167-178, doi: 10.1038/nrg2933 (2011).
Ingram, CR a kol.Abnormálna morfogenéza kože, končatín a kraniofaciálnej oblasti u myší s deficitom faktora-6 regulujúceho interferón (Irf6).Národná Genette.38, 1335-1340, doi: 10.1038/ng1903 (2006).
Peyrard-Janvid, M. a kol.Dominantné mutácie v GRHL3 spôsobujú van der Waordov syndróm a zhoršujú vývoj orálneho peridermu.Am J Hum Genet 94, 23–32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014).
Harris, MJ a Juriloff, DM Aktualizujte zoznam myších mutantov s defektmi v uzavretí neurálnej trubice a pokročte smerom k úplnému genetickému pochopeniu uzavretia neurálnej trubice.Vyšetrovanie vrodených chýb.Časť A, Klinická a molekulárna teratológia 88, 653–669, doi: 10.1002/bdra.20676 (2010).
Fantauzzo, KA & Soriano, P. PI3K-sprostredkovaná signalizácia PDGFRalfa reguluje prežitie a proliferáciu vo vývoji kostry prostredníctvom intracelulárnej dráhy závislej od p53.Gene Development 28, 1005–1017, doi: 10.1101/gad.238709.114 (2014).
Kopp, AJ, Green, ND a Murdoch, JN Disheveled: Vzťah konvergentnej expanzie k uzavretiu neurálnej trubice.Trendy v neurológii.26, 453-455, doi: 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003).